黄鳝nanos3基因克隆鉴定及其组织表达分析

何坤，吴华东，张士林，刘铮铮，阮记明，孙艺文，李福贵

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045）

0 引言

【研究意义】黄鳝（Monopterus albus）又名鳝鱼，隶属于合鳃鱼科（Synbranchidae）黄鳝属（Monopterus），具有很高的营养与经济价值，是我国重要的名特优淡水经济鱼类品种之一。据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，2020年我国黄鳝总产量多达30.7万t（农业农村部渔业渔政管理局等，2021）。黄鳝存在天然的性逆转现象，导致其繁育亲本及苗种资源稀缺，严重阻碍了黄鳝产业的迅速发展。目前，已有学者鉴定了黄鳝Sox9（刘利等，2001）、F64（蒋骄云等，2012）、piwill（陈梅，2021）、Dmrt3（宋颖等，2014）等性别决定或性腺分化相关的基因并开展其功能研究，但黄鳝性腺发育及性别分化机制尚未完全阐释清楚。因此，鉴定与性腺发育相关的基因并开展表达分析，不仅能为黄鳝性腺发育和性别分化分子机制研究提供基础资料，还可为开展黄鳝生殖细胞移植及性别控制育种研究提供参考依据。【前人研究进展】nanos基因最先在果蝇（Drosophila melanogaster）中发现，是一种母源性基因，能编码高度保守的RNA结合蛋白（Wang and Lehmann，1991）。Nanos蛋白一般含有2个调控翻译的特异锌指结构（Cys-Cys-His-Cys，CCHC）（Curtis，1997），在动物生殖细胞的存活、增殖、分化、迁移及全能性维持等方面发挥重要作用（程琳等，2020）。nanos基因在脊椎动物和非脊椎动物均已得到鉴定，在动物中一般存在1～4个nanos同源基因（de Keuckelaere et al.，2018），但在不同物种中发挥的功能不同。在果蝇中只有1个nanos基因，对其原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）的形成和迁移具有重要作用（Kobayashi et al.，1996；Wang and Lin，2004）。小鼠（Mus musculus）中含有3个nanos同源基因，其中nanos1基因在小鼠生殖细胞发育过程中不表达，且nanos1基因突变型小鼠发育正常，表明nanos1基因并非是小鼠性腺发育的必需基因（Haraguchi et al.，2003）；nanos2基因缺失突变的小鼠无法形成精原细胞，在雄性生殖细胞中特异表达，因此nanos2基因被用作小鼠雄性生殖细胞的特异分子标记；nanos3基因在小鼠精巢和卵巢中均有表达，敲除后会影响小鼠PGCs迁移，最终导致无法形成生殖细胞（Tsuda et al.，2003）。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）也含有3个nanos基因，单独缺失nanos1或nanos2基因时多数线虫PGCs尚能正常发育，但同时缺失nanos1和nanos2基因会导致线虫不孕；nanos3基因对线虫雌雄转换具有调节作用（Kraemer et al，1999）。斑马鱼（Danio rerio）虽然也含有3个nanos3基因，但与小鼠、线虫等动物的作用机制不同，其中nanos1基因在早期卵母细胞中表达（Draper et al.，2007）；nanos2基因在生殖干细胞中表达；nanos3基因在PGCs和生殖干细胞中均呈特异性表达，介导斑马鱼PGCs的形成和迁移，同时对斑马鱼卵母细胞的产生与维持起关键作用（Doerks et al.，2002；Saito et al.，2006；Beer and Draper，2013）。此外，在青鳉（Oryzias latipe）（Kurokawa et al.，2010；Guan et al.，2013）、鲤（Cyprinus carpio）（Kawakami et al.，2011）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）（Saito et al.，2011）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）（Li et al.，2015）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）（朱林等，2019）、、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Zhou et al.，2019）、稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）（Zhang et al，2022）等十几种鱼类中也鉴定出nanos3基因并开展其功能研究。由于nanos3基因具有特异的生殖细胞表达特征，通过其3′非编码区（3′-UTR）与荧光蛋白结合，实现PGCs的可视化分子标记，为鱼类PGCs移植提供了便利条件。【本研究切入点】作为低等脊椎动物模型代表，黄鳝在幼体阶段时性腺均单向分化形成卵巢，但在产卵后发生性逆转现象，由雌性转变为雄性，黄鳝天然的性逆转规律和调控机制使其成为研究脊椎动物性别分化发育机制的重要动物模型（Cheng et al.，2003；范淼等，2021），而具有较高的研究价值。【拟解决的关键问题】通过克隆黄鳝nanos3基因，并进行生物信息学、组织表达特征及性腺中细胞定位分析，明确nanos3基因在黄鳝卵巢发育和维持过程中的重要作用，为黄鳝PGCs可视化分子标记、生殖细胞移植及性腺发育分化机制研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从赣江支流中收集野生黄鳝个体156尾（体重40～250 g），雌雄比例约3∶1，养殖于江西农业大学校内实践教学基地的300 L蓝色养殖桶内，恢复摄食后每天正常投喂2次水蚯蚓，养殖1周后进行采样。以0.05%的MS-222将雌、雄各5尾黄鳝（表1）麻醉后，解剖采集其心脏、肾脏、脾脏、脑、卵巢/精巢、肌肉（背部白肌）、肝脏、肠道（后肠）和血液等组织样品，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用，各组织样品设3个生物学重复。

表1 供试黄鳝的生长数据Table 1 Growth data of tested M.albus

1.2 黄鳝组织总RNA提取

采用TRIGene法（GenStar）提取黄鳝各组织总RNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计（NanoDrop 2000）检测其质量及浓度合格后，-80℃保存备用。

1.3 黄鳝nanos3基因全长cDNA序列克隆

在GenBank中检索已知物种的nanos3基因序列，通过ClustalX 2比对分析获得保守区，然后使用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0设计扩增引物（表2）。以黄鳝卵巢组织总RNA为模板，利用StarSciptⅡ试剂盒（GenStar）反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系10.0μL：2×TaqPCR StarMix 5.0μL，cDNA模板0.8μL，上、下引物各0.4 μL，DEPC水3.4μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，进行34个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

根据获得的黄鳝nanos3基因中间片段序列，设计RACE扩增引物（表2），然后按照Invitrogen Race Manual说明进行3′-RACE和5′-RACE扩增。扩增产物经柱式DNA纯化试剂盒（GenStar）纯化回收后，连接至pMD18-T载体，再转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定呈阳性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果经SeqMan拼接即得到黄鳝nanos3基因全长cDNA序列（李创举等，2016）。

表2 黄鳝nanos3基因克隆、表达检测及原位杂交分析有关引物序列信息Table 2 Cloning，expression and in situ hybridization analysis of nanos3 gene in M.albus

1.4 黄鳝nanos3基因生物信息学分析

基于NCBI数据库进行nanos3基因序列比对分析及结构域预测；利用SeqBulider进行开放阅读框（ORF）查找及氨基酸序列推导；运用GeneDoc 3.2进行氨基酸序列多重比对分析，并以MEGA 7.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树（Bootstrap设为1000次）；同时参照张俊杰等（2021）的方法分别进行蛋白理化性质（ProtParam）、二级结构（SOMPA）、三级结构（SWISS-MODEL）、信号肽（SignalP）、跨膜结构域（TMHMM）及磷酸位点（Net-Phos）等预测分析。

1.5 黄鳝nanos3基因组织表达特征分析

利用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0设计实时荧光定量PCR扩增引物（表2），以β-actin为内参基因，雌性血液组织为参照组织，采用实时荧光定量PCR检测nanos3基因在雌、雄黄鳝不同组织中的表达水平。实时荧光定量PCR反应体系10.0μL：SYBR TB Green 5.0μL，ROX 0.2μL，cDNA模板1.0μL，上、下引物各0.4μL，DEPC水3.0μL。在荧光定量PCR仪上（Applied Biosystems Step One plusTM）进行扩增，扩增程序：95℃预变性30 s；95℃15 s，60℃1 min，进行40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，用于绘制熔解曲线以判断扩增产物的正确性。采用2–ΔΔCt法计算nanos3基因在雌、雄黄鳝不同组织中的相对表达量。

1.6 冰冻切片荧光原位杂交

设计探针引物（表2）并委托武汉赛维尔生物科技有限公司合成。经4% PFA固定过夜的黄鳝精巢和卵巢组织用30%蔗糖进行通透处理，OCT（Servicebio）包埋后冰冻切片，切片厚度为精巢7μm、卵巢8μm，利用合成的地高辛标记RNA探针进行冰冻切片荧光原位杂交（Ye et al.，2017），以抗淬灭剂封片，置于荧光显微镜（Nikon）下观察拍照。

1.7 统计分析

所有试验数据采用SPSS 25.0进行LSD多重比较和单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2.1 黄鳝nanos3基因cDNA序列及其氨基酸序列分析结果

获得的黄鳝nanos3基因cDNA序列全长1289 bp，包括147 bp的5′非编码区（5′-UTR）、531 bp的ORF及611 bp的3′非编码区（3′-UTR），共编码176个氨基酸残基（图1），提交至GenBank获得登录号为OM049822。CD-Search预测发现，在黄鳝Nanos3氨基酸序列第108～162位处存在2个锌指基序“CCHC”结构域，符合Nanos蛋白的结构域特征。黄鳝Nanos3蛋白二级结构（图2）中，以无规则卷曲（紫色字母c）的占比最高（64.20%），其次是α-螺旋（蓝色字母h，占24.43%），延伸链（红色字母e）、β-转角（绿色字母t）的占比分别为6.82%和4.55%；通过SWISS-MODEL预测黄鳝Nanos3蛋白三级结构，也发现存在2个明显的锌指基序（图3）。

2.2 黄鳝Nanos3氨基酸序列同源比对分析及系统发育进化树构建

Nanos3氨基酸序列多重比对分析结果（图4）表明，黄鳝Nanos3氨基酸序列与其他物种的Nanos3氨基酸序列具有较高的相似性，其中，与大刺鳅（Mastacembelus armatus，XP_026159755.1）的相似性最高，达67.5%；与射水鱼（Toxotes jaculatrix，XP_040892 060.1）、贝氏虹银汉鱼（Melanotaenia boesemani，XP_041837874.1）、黄姑鱼（Nibea albiflora，KAG80151 77.1）等鲈形目鱼类的相似性分别为57.2%、56.4%和56.0%；与鲤鱼（Cyprinus carpio，XP_018975458.2）、团头鲂（Megalobrama amblycephala，AYJ22255.1）、斑 马 鱼（Danio rerio，NP_571953.1）、异 育 银 鲫（Carassius gibelio，AKP99418.1）等鲤形目鱼类的相似性分别为51.2%、50.6%、50.3%和50.3%；与哺乳类动物及两栖类动物的相似性较低，尤其是与人类（Homo sapiens，NP_001092092.1）、小鼠（BAC8255 8.1）、中国林蛙（Rana temporaria，XP_040197996.1）和粗皮蛙（Glandirana rugosa，BBA26465.1）的相似性较低，分别为33.3%、30.9%、39.3%和30.3%。综上所述，Nanos3蛋白在进化过程中相对保守，黄鳝与鲈形目鱼类的相似性更高，其次是鲤形目鱼类，与哺乳类和两栖类等动物的相似性较低，符合传统的形态分类学结果。

基于Nanos3氨基酸序列相似性，通过MEGA 7.0构建系统发育进化树，结果（图5）显示，黄鳝先与射水鱼、黄姑鱼、大刺鳅及贝氏虹银汉鱼聚为一支，再与鲤鱼、团头鲂、斑马鱼、异育银鲫等鲤形目鱼类聚类成一大分支；两栖类动物中粗皮蛙和中国林蛙聚为一支；哺乳类动物人类和小鼠聚为一支。可见，黄鳝与鲈形目鱼类的亲缘关系较近，其次为鲤形目鱼类，其进化过程符合自然物种进化理论。

2.3 黄鳝Nanos3蛋白理化性质、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点及亚细胞定位预测分析结果

黄鳝Nanos3蛋白的理论等电点（pI）为9.07，为碱性蛋白；化学分子式为C859H1323N245O255S14，，分子量为19.61 kD。丝氨酸（Ser）在黄鳝Nanos3蛋白序列中的含量最高，占10.23%；其次是脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly），分别占9.09%和7.95%；精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酸（Glu）、亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、天冬氨酸（Asp）、苯丙氨酸（Phe）、天冬酰胺（Asn）、组氨酸（His）、蛋氨酸（Met）含量分别占6.82%、6.82%、6.82%、5.68%、5.11%、5.11%、5.11%、5.11%、4.55%、3.98%、3.98%、2.84%、2.84%和2.84%；谷氨酰胺（Gln）、异亮氨酸（Ile）、色氨酸（Trp）的含量最低，各占1.70%（图6），其中带负电荷的氨基酸残基总数为16个、带正电荷的氨基酸残基总数为24个。黄鳝Nanos3蛋白序列无跨膜结构域及信号肽，存在20个磷酸化位点（图7），包括10个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸化位点和2个酪氨酸磷酸化位点。黄鳝Nanos3氨基酸序列亚细胞分型分布在细胞核内的概率高达87.0%，分布在线粒体及过氧化物酶体中的概率分别为8.7%和4.3%，进一步说明黄鳝nanos3基因与其核遗传信息的传递相关。

2.4 nanos3基因在黄鳝不同组织中的表达情况

实时荧光定量PCR检测结果显示，nanos3基因在黄鳝肌肉中不表达，在精巢、肾脏、脾脏、脑、肝脏、肠道、心脏和血液中的相对表达量较低，但在卵巢中的相对表达量最高（图8），极显著高于在其他组织中的相对表达量（P＜0.01），呈明显的组织特异性表达模式。

2.5 黄鳝nanos3基因在性腺中的定位情况

为进一步探究黄鳝nanos3基因在性腺中的表达特征，通过冰冻切片荧光原位杂交分析黄鳝nanos3基因在精巢和卵巢中的表达情况，结果（图9）显示，黄鳝nanos3基因仅在生殖细胞中表达，支持细胞中未见表达。在精巢中，黄鳝nanos3基因在精原细胞中表达（图9-A），且主要是在细胞质中表达，细胞核中仅有少量表达（图9-B和图9-C）；在卵巢中，黄鳝nanos3基因在I期和II期卵母细胞及卵原细胞中大量表达（图9-D），且与精巢的表达模式相似，以细胞质中的表达为主，在细胞核中呈微弱表达（图9-E和图9-F）。

3 讨论

本研究利用RACE克隆获得的黄鳝nanos3基因cDNA序列全长为1289 bp，其中ORF为531 bp，共编码176个氨基酸残基。黄鳝与其他物种的Nanos3氨基酸序列多重比对分析结果表明，隶属于合鳃目的黄鳝与射水鱼、黄姑鱼、大刺鳅及贝氏虹银汉鱼等鲈形目鱼类高度同源，与鲤鱼、团头鲂、斑马鱼、异育银鲫等鲤形目鱼类的相似性次之，而与哺乳类动物和两栖类动物的相似性较低；基于Nanos3氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示，黄鳝先与射水鱼、黄姑鱼、大刺鳅及贝氏虹银汉鱼聚为一支，再与鲤鱼、团头鲂、斑马鱼、异育银鲫等鲤形目鱼类聚类成一大分支，即黄鳝与鲈形目鱼类的亲缘关系较近，其次是鲤形目鱼类，其进化过程符合自然物种进化理论（Li et al.，2015；钟东明等，2020）。

黄鳝Nanos3蛋白由20种氨基酸组成，分子量为19.61 kD，pI为9.07，亚细胞定位主要分布在细胞核内，故推测其可能与核遗传信息功能相关，与Doerks等（2002）的研究结果相似。黄鳝Nanos3蛋白二级结构中以无规则卷曲占比最高（64.20%），其次是α-螺旋（占24.43%），延伸链和β-转角分别占6.82%和4.55%；其三级结构预测发现存在2个明显的锌指结构域，与其他已知物种的Nanos3蛋白序列结构域相同（Andries et al.，2019）。黄鳝Nanos3蛋白序列无跨膜结构域及信号肽，存在20个磷酸化位点，包括10个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸化位点和2个酪氨酸磷酸化位点。磷酸化位点对细胞功能和蛋白调节起重要作用，磷酸化位点突变可能会导致蛋白降解，进而影响生殖细胞的发育过程（Yamaji et al.，2010）。因此，推测黄鳝的性逆转与Nanos3磷酸化位点的突变有关，但具体机理有待进一步探究验证。

nanos3基因对原始生殖细胞的迁移具有调控作用，在卵母细胞的产生和维持及生殖细胞发育分化过程中发挥重要作用（于萌等，2012）。已有研究证实，nanos3基因在大黄鱼（Larimichthys crocea）卵巢中高表达，在精巢和肝脏中有少量表达（Han et al.，2018）；nanos3基因同样在团头鲂卵巢中高表达，在其他组织中不表达（朱林等，2019）；而在粗皮蛙等两栖类动物中，nanos3基因在精巢中高表达，在卵巢、肾脏和肺脏中有少量表达（Kodama et al.，2018）；在羊、人类等哺乳动物中，nanos3基因脑、卵巢、肝脏及睾丸等组织中均有表达，但以在睾丸中的表达量相对较高（Grelet et al.，2015；Zhao et al.，2020；Yang et al.，2022）。本研究结果表明，在雌性黄鳝中，nanos3基因在卵巢中高表达，在其他组织如肝脏、脾脏、肠道等中有少量表达；在雄性黄鳝中，nanos3基因在精巢中有少量表达，而其他组织中几乎不表达。由此可知，nanos3基因在不同物种间的表达模式存在明显差异，黄鳝nanos3基因的表达模式介于两栖类和鱼类之间，可能与基因互作关系有关（Suzuki et al.，2014）。此外，冰冻切片荧光原位杂交结果显示黄鳝nanos3基因在生殖细胞中大量表达，而在支持细胞中不表达，与实时荧光定量PCR检测结果基本吻合。大鼠和人类的研究结果也表明，nanos3基因在生殖细胞中高表达，在体细胞中微弱表达，甚至不表达（Jørgensen et al.，2012；Kim et al.，2018），进一步证实nano3基因是脊椎动物性腺发育及分化相关的功能基因。

4 结论

黄鳝nanos3基因进化相对保守，主要在卵巢的生殖细胞中表达，且以细胞质中的表达为主，与核遗传信息的传递相关，是黄鳝性腺发育及分化相关的功能基因。