血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p在慢性心力衰竭大鼠中的表达及意义

李秀芩，陈少鹏，邵伟华，王素星，李 芳，姚丽霞

(河北省人民医院老年心血管内科，石家庄 050051;*通讯作者,E-mail:83312832@qq.com)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心肌肥厚等心脏疾病变诱发心室收缩、舒张功能损伤的一种综合征，具较高致残率和死亡率，患者预后较差，心脏结构和功能损伤时表现为射血功能障碍、血液灌注不足，早期诊断和治疗可减缓CHF发展进程[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)属于内源性非编码单链RNA分子，可与mRNA 3′-非翻译区(3′UTR)结合，降解mRNA，抑制蛋白翻译，并可调节细胞生长和凋亡等生物学行为，参与多种生理病理过程，已有研究表明miRNA与CHF严重程度相关[2,3]。因而深入探究miRNA与CHF发生发展的相关性具有重要意义。微小RNA-423-5p(miR-423-5p)在CHF患者血清中表达水平升高，且与CHF患者预后有关[4]。CHF患者中微小RNA-499-5p(miR-499-5p)呈高表达，且与氨基末端脑利钠肽前体(NTpro-BNP)浓度呈正相关，可作为峰值摄氧量(VO2)的预测因子，可能作为判断CHF进展标志物[5]。CHF患者血浆中微小RNA-210-3p(miR-210-3p)表达上调，且与NTpro-BNP显著相关，并可能作为评估患者预后的标志物[6]。但血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与CHF标志物相关性尚未完全阐明。因此，本研究采用腹腔注射阿霉素建立CHF模型，探讨血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p在CHF大鼠中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

30只SPF级大鼠(体质量120～180 g)购自厦门万泰沧海生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(闽)2018-0002。饲养温度25～27 ℃，湿度40%～70%，常规饲养。

1.2 方法

1.2.1 构建模型与实验分组 30只大鼠适应性喂养3 d后随机分为NC组(n=15)和CHF组(n=15)。NC组：常规饲养，不进行处理。采用腹腔注射阿霉素建立CHF模型[7]：灭菌水溶解阿霉素制备浓度为0.25 mg/ml溶液，1次腹腔注射2.5 mg/kg，1次/周，连续注射6次，累积剂量为15 mg/kg。采用Vevo3100型心脏彩超仪(佰泰科技有限公司)检测左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)，LVEF和LVFS降低20%～30%视为造模成功[8]。

1.2.2 采用超声心动图仪检测大鼠心功能指标 建模6周后禁食12 h，采用HIVISION超声心动图仪(日本东芝)检测左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)、左室射血分数(LVEF)，探头频率为2.5 MHz。

1.2.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p的表达水平 分别抽取NC组和CHF组建模1，2，6，12，24 h及建模6周后大鼠腹主动脉血液样本3 ml，3 500 r/min离心10 min提取血清，采用qRT-PCR法检测血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表达水平。miRcute miRNA提取分离试剂盒用于提取血清总RNA，RNA反转录合成cDNA，反转录过程按照cDNA第一链合成预混试剂说明书操作。miR-423-5p正向引物5′-TGAGGGGCAGAGAGCGA-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-499-5p正向引物5′-CGTGTCGACCAAGTCTGGGGTGAAAGAGAAG-3′，反向引物5′-TGTGTCGACGGTCATGAGCTTGTTGAGGTTC-3′；miR-210-3p正向引物5′-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3′，反向引物5′-TATCTGTGCGTGTGACAGCGGCT-3′；内参U6的正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至25 μl；反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循环。采用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测并以2-ΔΔCt法表示miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p相对表达量。

1.2.4 采用免疫荧光法和ELISA法检测大鼠血清NTpro-BNP和cTnI水平 分别抽取NC组和CHF组大鼠6周后腹主动脉血液样本3 ml，3 500 r/min离心10 min提取血清，采用免疫荧光法检测NTpro-BNP水平，采用ELISA法检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组大鼠心功能指标比较

与NC组比较，CHF组心功能指标LVEDV和LVESV升高，LVEF降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 两组大鼠心功能指标比较Table 1 Comparison of cardiac function indicators between the two groups

2.2 两组大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表达水平比较

建模6周后，与NC组比较，CHF组血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表达水平升高(P<0.05，见表2)。

2.3 两组大鼠血清NTpro-BNP、cTnI表达水平比较

建模6周后，与NC组比较，CHF组血清NTpro-BNP和cTnI水平显著升高(P<0.05，见表3)。

2.4 miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与心功能指标相关性分析

采用Pearson法分析CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与心功能指标相关性，结果显示，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与LVEDV、LVESV、LVEF无明显相关性(P>0.05，见表4)。

表2 两组大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表达水平比较Table 2 Comparison of serum miR-423-5p, miR-499-5p and miR-210-3p expression levels between two groups

表3 两组大鼠血清NTpro-BNP、cTnI表达水平比较Table 3 Comparison of serum NTpro-BNP and cTnI levels between the two groups

表4 CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与心功能指标的相关性Table 4 Correlation of serum miR-423-5p, miR-499-5p and miR-210-3p with cardiac function indexes in CHF rats

2.5 miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与NTpro-BNP相关性分析

采用Pearson法分析血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与NTpro-BNP相关性，结果显示，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p均与NTpro-BNP呈正相关(r分别为0.668，0.622，0.532，均P<0.05，见图1)。

图1 CHF大鼠miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与NTpro-BNP的相关性分析Figure 1 Correlation of miR-423-5p, miR-499-5p, miR-210-3p with NTpro-BNP in CHF rats

2.6 miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与cTnI相关性分析

采用Pearson法分析CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与cTnI相关性，结果显示，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p均与cTnI呈正相关(r分别0.663，0.598，0.533，均P<0.05，见图2)。

图2 CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与cTnI相关性分析Figure 2 Correlation of serum miR-423-5p, miR-499-5p, miR-210-3p with cTnI in CHF rats

3 讨论

miRNA表达异常与CHF发生发展密切相关，多项研究表明miRNA可调节靶基因表达，进而参与CHF发生过程[9,10]。

CHF主要表现为心功能异常，心功能指标主要为LVEDV、LVESV和LVEF，本研究结果显示，CHF大鼠心功能指标LVEDV和LVESV升高，LVEF降低，提示CHF模型建立成功。miR-423-5p在CHF患者血清中表达上调，且与心功能密切相关，可作为评估CHF严重程度的标志物[11]。本研究结果显示，CHF大鼠血清miR-423-5p表达水平升高，与上述研究结果相似。提示miR-423-5p在CHF发展进程中可发挥重要调控作用。miR-423-5p表达量与CHF症状严重程度呈正相关，并可用于评判临床疗效[12]。miR-499-5p可靶向p21进而参与阿霉素诱导的心肌细胞损伤过程[13]。本研究结果显示，CHF大鼠血清中miR-499-5p表达水平升高，提示miR-499-5p可能作为早期诊断CHF的标志物。miR-499可作为早期诊断急性心肌梗死的标志物[14]。本研究结果表明miR-499-5p负向调控p21表达，并调节心肌细胞增殖和凋亡等，参与CHF发展过程。脓毒症大鼠血清miR-210-3p表达水平增高，可与NADH脱氢酶1α亚复合物4(NDUFA4)结合，促进心肌细胞凋亡，损害线粒体功能[15]。miR-210-3p过表达可抑制靶基因ATG7表达，促进炎症因子表达、细胞细胞增殖，抑制细胞凋亡，进而促进急性肺损伤[16]。氧-葡萄糖剥夺(OGD)诱导的内皮祖细胞(EPC)中miR-210-3p表达上调，促进EPC增殖、迁移，其作用机制与靶向调控RGMA有关[17]。本研究结果显示，CHF大鼠血清miR-210-3p表达水平升高，其作用机制可能与靶向调控NDUFA4、ATG7、RGMA有关。同时本研究发现，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与LVEDV、LVESV呈正相关，且与LVEF呈负相关，但均无统计学差异，这可能与样本量小有关。

miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p与NTpro-BNP和cTnI相关性尚未明确。NTpro-BNP和cTnI作为CHF心肌损伤标志物，其水平与CHF症状、心肌损伤严重程度有关[18,19]。已有研究表明miRNA表达异常与NTpro-BNP有关，NTpro-BNP属于心源性神经激素，对CHF诊断具有特异性[20,21]。miRNA表达量与cTnI有关，cTnI水平升高表明CHF患者心肌损伤较为严重[22,23]。本研究尝试性分析显示miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p均与NTpro-BNP、cTnI呈正相关，提示随着miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p水平升高，CHF大鼠心肌损伤和心衰程度愈加严重，下调miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p水平，可能改善CHF心衰症，可能作为监测CHF病情进展的标志物。

综上所述，CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p表达水平升高，均与NTpro-BNP和cTnI呈正相关，可能成为评估CHF严重程度的潜在生物标志物。但其可能作用机制尚未明确，仍需更多基础研究、临床试验进行验证。