基于网络药理学与分子对接技术探讨益气解毒通络方治疗肝硬化的潜在机制

熊永强 ,李江伟 ,李韧 ,黄娜 ,巩妮 ,张澍

(西安交通大学第二附属医院:1.干部病房普通外科;2.科研中心实验室,陕西西安 710004)

肝硬化是各种慢性肝损伤机制导致的炎症坏死、纤维化及假小叶形成[1-2],其原因多种多样,如肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酒精性或非酒精性脂肪肝病[3],其特点是细胞外基质(ECM)的合成和降解不平衡,导致明显的ECM 沉积[4]。肝硬化最终可能发展成肝衰竭和肝癌,这极大地影响患者的生存和生活质量[5]。肝硬化中药复方治疗可基本分为经典方、现代名家名方和自拟方。中药复方治疗体现了病证结合的辨证思想,针对肝硬化病因、分期、并发症、特有临床指标辨证施治,在改善临床症状、阻止及预防和治疗并发症方面有显著优势。相关研究证明,益气解毒通络方(YQJDTLF)可明显缓解临床症状,疗效显著。本研究利用网络药理学方法确定YQJDTLF 治疗肝硬化的潜在机制,以助于肝硬化药物的筛选,改进YQJDTLF的剂型,并为探索其他中药的治疗机制提供有益的可能参考。

1 材料与方法

1.1 YQJDTLF的活性化合物和相应潜在治疗靶点的筛选

应用TCMSP[Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(tcmsp-e.com)]筛选YQJDTLF 的活性化合物和相应的潜在治疗靶点[6]。在TCMSP 中检索YQJDTLF中相对生物利用度(OB)≥30%、药物相似度(DL)≥0.18被设置为活性化合物和相应的潜在治疗靶点筛选的阈值。

1.2 肝硬化相关治疗靶点的筛选

肝硬化相关靶点筛选通过搜索如下数据库进行,如Drugbank(https://go.drugbank.com/structures/search/small_molecule_drugs/structure)[7]、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[8]、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)[9]、GeneCard(http://www.genecards.org)[10],检索名词为肝硬化。删除重复的靶点基因以获得最终的疾病靶点合集。

1.3 YQJDTLF 蛋白互作网络及成分-靶点-疾病网络的构建

将检索获得的YQJDTLF 相关靶点和肝硬化相关靶点进行维恩图分析,找出交叉的目标,然后用Cytoscape(Cytoscape_v3.8.2)构建药物-化合物-靶点基因图网络[11]。网络中的节点代表YQJDTLF 中的活性化合物和靶点,网络中的边代表每个节点的关系,每条边的数量被定义为“度”。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建主要是通过交叉靶点上传至String 在线数据库(https://string-db.org)生成的[12]。所需的最低交互分数设置为“中等置信度=0.9”,而其他参数保持默认,然后将生成的PPI网络加载到Cytoscape。进一步利用CytoCNA 的内置模块生成主要目标网络,当介数、接近度、度/连通性、特征向量、基于局部平均连通性的方法和每个节点的网络都大于中位数时,通过拓扑分析生成核心目标网络。

1.4 基因本体论(GO)生物学功能富集及基因组百科全书(KEGG)通路分析

使用Metascape(http://metascape.org/)进行了GO 和KEGG 的通路富集分析,以P-Value 值(P≤0.01)为筛选条件,GO 分析依据相关性选用靠前的10位生物学过程(biological process,BP)、前10位分子功能(molecular function,MF),将KEGG的前20条富集途径在气泡图中可视化,气泡的大小代表在指定途径中富集的目标数量,气泡的颜色代表富集的P值,富集分析的KEGG通路以及相应的化合物和靶标随后被加载到Cytoscape软件中,通过单独调整绘图,生成了一个可视化的化合物-目标-通路网络。

1.5 分子对接

从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载PPI网络中相互作用核心蛋白的3D 结构,并从PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)及ZINC数据库(http://zinc.docking.org)下载活性小分子的3D结构。应用AutoDock Tools 1.5.6对获取的小分子及蛋白3D结构进行去水、加氢、计算电荷等处理后,导入到AutoDock Vina进行对接,计算出药物活性成分与靶蛋白相结合所需的最低结合效能,通过Rx64 4.1.3将核心蛋白及小分子结合能绘制热图,再利用Pymol2.1.1将对接所获得的相互作用结构进行可视化处理。

2 结果

2.1 主要化学成分及靶点

通过TCMSP数据库查找YQJDTLF 的所有成分,根据药动学参数筛选出其中口服OB≥30%且DL≥0.18的潜在活性成分及相应靶点,YQJDTLF的活性化合物93个,相应潜在治疗靶点1 460 个(表1)。将“肝硬化”置于Drugbank、OMIM、TTD、DisGe NET、GeneCard搜索,经过筛选最终获得总共1 266个肝硬化相关靶点基因,中药成分-潜在靶点基因网络图由Cytoscape构建(图1)。

图1 YQJDTLF-中药成分-潜在靶点基因网络图Fig.1 Yiqi Jiedu Tongluo Recipe-Traditional Chinese Medicine Ingredients-Potential Target Gene Network Map

表1 YQJDTLF的中药成分和相应的潜在治疗靶点数目Tab.1 The number of Chinese herbal components and corresponding potential therapeutic targets of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe

2.2 药物-化合物-靶点基因图网络的构建

得到YQJDTLF和肝硬化相关的潜在靶点后,通过维恩图确定相交的靶点,得到YQJDTLF与肝硬化交集靶点共135个(图2)。根据化合物中靶点基因数目筛选活性化合物,筛选出前10位活性化合物(表2)。

表2 YQJDTLF的中药化合物相关靶点Tab.2 Targets related to traditional Chinese medicine compounds in Yiqi Jiedu Tongluo Recipe

续表2

图2 YQJDTLF与肝硬化的交集靶点维恩图Fig.2 Venn diagram of intersection target of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe and liver cirrhosis

2.3 PPI网络及关键成分和靶点分析

由String 数据库(https://www.string-db.org/)构建的蛋白PPI网络,生成主要目标网络,截断值设置如下:节点=135,边=697,度数中位数=10.3,PPI网络中的节点愈大、颜色愈深,此节点蛋白与其他节点蛋白的作用关系就越多,重要性就越强(图3)。将YQJDTLF与肝硬化的核心靶点分别导入Cytoscape,生成相应的网状图,进一步利用CytoCNA 内置模块生成主要目标网络,并通过拓扑分析,得到核心网络。利用MOCDE 插件筛选出10个药物治疗疾病的核心靶点,包括肿瘤蛋白p53(TP53)、AKT1、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)、MAPK8、胱天蛋白酶3(CASP3)、JUN、信号转导与转录激活子3(STAT 3)。

图3 YQJDTLF与肝硬化交叉靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络Fig.3 Protein-protein interaction (PPI) network of crosstargets between Yiqi Jiedu Tongluo Recipe and liver cirrhosis

2.4 核心靶点GO 生物学功能及KEGG 通路富集分析结果

将YQJDTLF治疗肝硬化的135个核心靶点导入Metascape数据库,得到富集的通路与核心靶点网络图(图4),说明YQJDTLF是通过多条通路与多个靶点相互配合,共同起到治疗肝硬化的目的。以P＜0.01为筛选条件,GO 分析获得813条生物过程(BP)主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter)、基因表达的正向调控(positive regulation of gene expression)、信号转导(signal transduction)等,79条细胞组成(CC)主要涉及胞质溶胶(cytosol)、细胞核(nucleus)、细胞质(cytoplasm)、核质(nucleoplasm),127条分子功能(MF)主要涉及蛋白质结合(protein binding)相同的蛋白质结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)等,各选取前10条信息如图5A(图中的Count值代表与此条目相关的靶点基因的数量,Count值愈大,代表相关的靶点基因数量愈多)。以P＜0.01为筛选条件,KEGG 富集分析获得135条信号通路,选择前20条KEGG 通路并以气泡图方式呈现,气泡的大小代表在指定途径中富集的目标数量,气泡的颜色代表富集的P值。富集程度较高的代谢通路为pathways in cancer、fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等(图5B)。

图4 YQJDTLF治疗肝硬化的135个核心靶点导入Metascape数据库获得的富集通路与核心靶点网络图Fig.4 Enrichment pathway-core target network diagram

图5 YQJDTLF治疗肝硬化的核心靶点GO 分析(A)和KEGG 分析(B)的结果Fig.5 The results of GO analysis(A)and KEGG analysis(B)of the core targets of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe in the treatment of liver cirrhosis

2.5 分子对接结果

为了明确YQJDTLF治疗肝硬化的内在分子机制,选取PPI网络中的10个关键靶点作为受体,选择筛选的活性化合物作为配体。当配体与受体结合能量越低时,其结合构象越稳定,相互作用的可能性越大。分子对接中最低化学结合能小于0 kJ/mol时可以在自然状态下对接,最低化学结合能小于＜-5 kJ/mol时,对接结果良好。从分子对接热力图可看出关键基因与有效成分对接后,CASP3、STAT3与活性化合物结合能处于0～5 kJ/mol,其余靶点与活性化合物最低化学结合能小于＜-5 kJ/mol(图6),提示有效成分有可能成为先导药物,为药物的设计开发提供思路。利用Pymol 软件将结合能较低的相关靶点蛋白与有效成分的蛋白对接模式进行可视化结果(图7) 。

图6 活性成分与潜在靶点对接结果热图Fig.6 Heat map of the docking results of active ingredients and potential targets

图7 核心靶点分别与其结合能最低活性化合物生成的对接模式图Fig.7 The docking pattern of the core target and its lowest binding energy compound

3 讨 论

2007年HOPKINS[13]首次明确网络药理学概念。网络药理学在中药领域的应用可解决中药现代化遇到的困难,揭示潜在的机制。北京东直门医院徐光福教授[14]自拟YQJDTLF 治疗肝硬化患者,取得满意效果。本研究利用网络药理学明确YQJDTLF 对于肝硬化的治疗的相关可能机制,为今后研究中药配方治疗肝硬化的具体机制提供了参考。本研究使用TCMSP、GeneCard、KEGG、TTD、DrugBank和Dis-GeNET 明确药物相关基因可能是YQJDTLF 改善肝硬化的关键靶点,然后生成化合物-靶点的PPI网络,并通过使用Cytoscape和String数据库确定核心靶点,对核心靶点的GO 和KEGG 富集分析显示,介导的pathways in cancer、fluid shear stress and atherosclerosis等相关信号通路是最富集的通路。

研究显示,槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、黄芩素(baicalein)、小红参醌丙(trijuganone B)、异鼠李素(isorhamnetin)、豆甾醇(stigmasterol)是YQJDTLF治疗肝硬化的主要活性化合物。槲皮素属于黄酮醇家族,具有抗氧化、抗炎、保护心脏和抗肥胖的作用[15],参与调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT 和细胞外信号调节激酶1/2/c-Jun N 端激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK-1/2/JNK/MAPK)信号通路[16],以及通过调控细胞色素C参与凋亡途径[17]。黄芩素是一种从黄芩根中提取的黄酮类化合物,可诱导人肝母细胞瘤细胞(Hep G2)凋亡,黄芩素可能是急性肝细胞凋亡或损伤的治疗候选药物[18-20]。槲皮素和黄芩素还显示出体外抗纤维化活性,可抑制TGF-β1诱导的结节形成[21-22]。木犀草素能增加了肝脏基质金属蛋白酶-9的水平和金属硫蛋白(MT)Ⅰ/Ⅱ的表达,可消除纤维蛋白沉积物,促进纤维化肝组织中的ECM 降解和增强肝再生能力来治疗肝纤维化[23]。异鼠李素可以抑制TGF-β1表达,从而影响TGF-β1/Smad3 及TGF-β1/p38 MAPK 通路的活化,缓解氧化应激从而起到抗纤维化的作用[24-25]。而越来越多的研究证实,线粒体激活的蛋白激酶(MAPK)下游信号在肝硬化病程中起着重要的作用[26]。Smads、ERK/MAPK、PI3K/AKT、NF-κB、PPAR 等信号通路是肝硬化发生发展过程中细胞因子发挥作用的重要信号通路。

通过cytoscape软件拓扑分析得出YQJDTLF治疗肝硬化的核心靶点基因有TP53、AKT1、VEGFA、IL6、TNF、MAPK3、MAPK8、CASP3、JUN、STAT 3。TNFα参与TNF受体相关因子(TRAF)2、受体相互作用蛋白-1、丝裂原活化蛋白(MAP)激酶、c-Jun-N末端激酶(JNK)、核因子κB(NFκB)通路的调控[27],而TNF/TNFR1 复合物可以引起caspase-8 的激活[28],caspase-8可激活如caspase-3的下游效应子,从而诱发凋亡细胞死亡[29-30],这些通路对肝损伤、肝硬化进展起着一定的作用。蛋白激酶(AKT)是PI3K 信号通路的主要下游点,AKT1通过IKKα激活NF-κB 参与多种促炎反应作用的共同通路,从而调节炎症反应介导肝硬化的发生[31-33]。

GO 富集分析主要集中在凋亡过程的负调控、药物敏感性、炎症反应、细胞增殖的正调节等。肝细胞凋亡导致的肝细胞死亡是肝硬化演变过程中炎症和肝星状细胞活化的主要触发因素[34-35],靶点基因参与凋亡过程中的负调控有利于肝硬化的治疗。病毒性肝炎是肝硬化疾病进展诸多因素中的最主要因素之一。乙型肝炎病毒能引起免疫应答导致肝细胞损伤及炎症坏死,肝细胞进入“炎性坏死与再生修复”的循环中,部分患者最终发展为肝硬化[36-38],炎症反应调控对于改善肝硬化结局是有益的。KEGG 分析得出YQJDTLF通过pathways in cancer、TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway 等通路在肝硬化的治疗中发挥作用。pathways in cancer是富集程度最高的通路。通路靶点图可以看出该复方主要通过干预关键靶点的上下游基因,而发挥对pathways in cancer中的ERK signaling、TGF-βsignaling pathway、calcium signaling、nuclear receptor signaling、cell cycle G1/S 等信号通路的间接调控作用。研究发现,肝硬化的发生和发展与Raf/MEK/ERK信号通路有密切的关系,若抑制该通路的活性,可起到抑制星状细胞肝的增殖、促进其凋亡的作用[39-40]。TGF-β是生理(伤口愈合)和病理纤维发生的主要调节因子[41]。本研究结果表明,该中药复方通过调控AR 参与androgen receptor signaling pathway,可能起到干预肝硬化进一步进展的作用。THOLE 等[42]报道,使用甾体或非甾体抗雄激素可能会导致肝硬化,表明雄激素/AR信号可能会阻止肝硬化的进展。在小鼠模型研究中,WU 等[43]证明AR 在促进HBV复制和肝炎中起关键作用,其发现肝细胞中AR的敲除导致HBV复制减少。雄激素/AR信号抑制脂肪变性的发展,也可能抑制肝硬化的发展。在非癌性肝病的研究中,肝病AR敲除小鼠模型显示雄激素/AR信号可以抑制脂肪变性、病毒相关肝炎和肝硬化的发展。

通过对核心靶点对关键靶点和关键中药成分进行分子对接研究,除了CASP3、STAT 3与活性化合物结合能处于0～5 kJ/mol,其他对接复合物的最低结合能都小于-5.0 kJ/mol,其中IL6 与豆甾醇结合能为-11.1 kJ/mol。一般认为,结合能小于-4.25 kJ/mol、-5.0 kJ/mol或-7.0 kJ/mol分别表示配体和受体之间的特定、良好或强的结合活性[44],表明这些中药成分都能够较好地结合到关键靶点蛋白的活性位点中。

综上所述,本研究基于网络药理学与分子对接的方法学,通过对YQJDTLF 中的化学活性成分的生物学功能通路富集分析,阐明了其通过肿瘤相关通路等生物学过程,参与治疗肝硬化过程的分子机制。并通过分子对接初步验证了化学活性成分与肝硬化疾病靶点的相互作用模式。而目前的研究工作主要来自生物信息学分析,未来可采用体外和体内的实验验证。本研究为后续的研究奠定了思路基础。