于普光,冯家劲,占学康,李 健,任 帅,陈科明,韦秋绫,何 瑞,李广永
(1宁夏医科大学临床医学院,银川 750004;2宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室;3宁夏医科大学总医院泌尿外科;*通讯作者,E-mail:guangyongli1979@126.com)
阴道是女性的生殖器官,既是产道的一部分,也是主要的性器官。与肠管等其他管状器官相似,阴道是一个由三层组织(即黏膜层、肌层和外膜)组成的中空管状结构,其黏膜层是非角化的鳞状上皮,阴道肌层为平滑肌,肌束之间纵横交错成网格状,阴道组织的血管和神经分布于此[1]。发生在阴道的众多疾病如非特异性阴道炎、阴道肌层病变、阴道囊肿、阴道上皮病变、阴道癌前病变、阴道癌等,都与血管神经病变有密切关系[2]。近年来,基于阴道肌层神经血管病变导致的疾病如萎缩性阴道炎、女性性功能障碍等的研究越来越多,这一系列疾病都说明血管神经在疾病发生发展中的重要性[3],而我们传统的切片只是对组织进行冠状位或矢状位的切割,尤其对于血管和神经这样的组织不能充分显示其完整性和走向分布。因此,本研究拟寻找一种新的可以显示阴道血管和神经全层的实验方法,用于完整地显露阴道组织神经血管层,为阴道相关疾病的研究提供新的方法和技术支持。
分别取雌性SD大鼠和ICR小鼠各20只作为研究对象,动物均由宁夏医科大学实验动物中心提供(10752309202000082)。
本研究主要用到的试剂有丙酮溶液、10%中性缓冲福尔马林(含4%甲醛)(上海至鑫化工有限公司),HE染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒和甘氨酸银染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)、CD31单克隆抗体(Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司)、外科显微器械(金钟上海医疗器械有限公司)、立体式显微镜(德国徕卡Leica上海聚慕医疗有限公司)、防滑托载玻片和盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)。
大鼠用10%水合氯醛以0.01 ml/g的剂量,小鼠用5%水合氯醛以0.01 ml/g的剂量行腹腔注射麻醉。待麻醉满意后,在耻骨联合上方做一1 cm切口剪开皮肤,逐层暴露,取下阴道组织,顺着长轴剪开,在PBS中浸泡3 min左右后,将大鼠和小鼠的阴道组织分别放在提前预冷的4 ℃丙酮溶液与10%中性缓冲福尔马林(pH 7.2~7.4)中固定,将组织放入4 ℃冰箱,在每种固定液中分别固定24 h和48 h,次日取出后再次用PBS冲洗干净用于制作铺片。
将固定好的阴道组织放于盛有PBS的玻璃皿中,在立体式显微镜下将阴道组织用眼科剪分成合适大小的组织块,如图1所示,使用两把显微镊,一把镊子用于固定,另一把镊子从组织的一个角剥起,剥离时动作应轻柔,勿将组织撕坏,若一边不好剥离,可以换一边剥起,总之从四个角向中间剥相对容易,不容易把组织撕坏,先剥离黏膜层,待黏膜层剥离干净后,翻转组织另一面,剥离最外侧浆膜层,然后逐渐剥离干净,留下肌层即神经血管所在层。将剥离好的组织泡在PBS中待用。
A.肉眼下的操作 B.显微镜下的铺片图C.将分离好的组织贴在载玻片上图1 制作铺片的关键步骤展示Figure 1 Display of the key steps in making a full-thickness slice
在用中性缓冲福尔马林和丙酮固定24 h后,对大鼠和小鼠的阴道铺片进行以下染色,并统计分析不同固定方法下组织脱片率。
1.5.1 HE染色 将制备好的铺片放入苏木素染液浸染3 min,冲水反蓝15 min,放入盐酸酒精中分化3 s,冲水,放入伊红溶液中1 min,冲水15 min,在显微镜下观察染色情况,满意后脱水,用中性树胶封片。
1.5.2 嗜银染色 将制备好的铺片放入甘氨酸银染液C处理5 min,蒸馏水漂洗3次后放入甘氨酸银染液B(已提前37 ℃预热好)中处理3~5 min,再放入甘氨酸银染液A(已提前15 min于45 ℃预热好)中,在显微镜下观察还原效果,数秒后快速拿出,蒸馏水冲洗,如遇到染色背景过深需要用甘氨酸银染液D处理,并用蒸馏水漂洗后脱水封片。
1.5.3 CD31免疫组化染色 将预先制好的铺片用PBS漂洗3次,用微波炉在0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中抗原修复15 min(丙酮固定的组织不需要此步骤),待自然冷却后加0.3%Triton-X100一滴孵育15 min,山羊血清工作液室温封闭1 h,滴加一抗工作液CD31至于摇床上,4 ℃过夜;第2天从冰箱里拿出片子自然复温30~60 min,PBS冲洗后加二抗,放入37 ℃孵箱孵育30 min,用DAB显色液在显微镜下观察显色,显色完成后用苏木精染液染色4 min,盐酸酒精分化,冲水返蓝25 min,走上行梯度酒精脱水,中性树胶封片。
1.5.4 Masson染色 脱水、封片均同HE染色,用试剂盒中的Masson复合染色液染色5 min,0.125%醋酸水溶液稍加清洗后放入5%磷钨酸染液中染色5 min,用0.125%醋酸水溶液清洗2次,每次3 min,在用亮绿染液染色5 min后0.125%醋酸水溶液清洗2次,脱水并封片。
采用Fisher确切概率法统计分析不同固定方法下组织脱片率的差异,P<0.05认为差异有统计学意义。
在实验过程中,两种固定液都能很好地对阴道组织起固定作用,同种固定液固定24 h和48 h脱片无显著差异(见表1);不同的固定方式和固定时间对脱片的发生并没有统计学意义(Fisher确切概率法,P小鼠=0.893和P大鼠=0.429,见表1),但中性缓冲福尔马林固定后组织较韧,更易剥离各层组织,而丙酮固定的组织易碎,组织不完整。
表1 不同固定方式对脱片的影响 (例)
通过对铺片进行HE染色、Masson染色、嗜银染色和用于标记显示血管的CD31免疫组化染色发现,HE染色能显示阴道肌层的大体结构,用于常见的形态学研究;Masson染色能很好地显示胶原纤维和肌纤维,胶原纤维呈蓝色或绿色,肌纤维呈红色;嗜银染色可用于神经纤维的染色,暗黑色的组织即神经纤维的走形;CD31是血管内皮的标志物,常用于血管的标记(见图2)。
在染色过程中,不同的固定方式和时间对HE染色、Masson染色和嗜银染色的结果并没有大的影响,这3种染色均能充分反映阴道组织铺片的大体形态、胶原纤维和肌纤维的分布,以及神经纤维的分布。但在免疫组化染色中,在同一实验条件下,用DAB显色液显色相同的时间,用中性缓冲福尔马林固定的组织要比丙酮固定的组织更容易染色,但中性缓冲福尔马林24 h和48 h染色结果没有差异(见图2)。
阴道正常生理功能的维持,除肌纤维、筋膜和韧带组织外,还需要营养肌纤维的血管、调控肌纤维的神经组织和阴道自身的应激反应功能[4,5]。在本研究中,通过对比丙酮和中性缓冲福尔马林两种固定剂对组织固定效果、组织质地及剥离难易程度的影响,来寻找制作铺片最理想的固定剂和实验条件。通过实验发现,两种固定液都能很好地对阴道组织起固定作用,这与宋岩彪等[6]的研究结果相一致。丙酮是一种易挥发液体,可使蛋白质沉淀,渗透力强,因此更适用于像阴道这种较韧组织的固定[7],但不适用于固定细胞微丝骨架[8],对糖原等黏多糖物质也无固定作用[9],因此相比于中性缓冲福尔马林有较大的局限性。在是否容易脱片、细胞形态等方面无显著差别,而且同种固定液固定24 h和48 h无显著差别,因此建议固定满24 h即可,时间短可能会影响固定效果,但超过24 h后继续延长固定时间将无意义。在对组织质地影响方面,经中性缓冲福尔马林固定后的组织相对较韧,更易剥离各层组织,而丙酮固定的组织易碎,组织不完整。从实验结果来看,不同的固定方法对HE染色结果影响不大,但杨群等[4]认为含有甲醛的固定液会使组织结构更清晰,在HE染色方面要优于丙酮和95%乙醇。免疫组化染色对固定液的要求更高,相比于丙酮,中性缓冲福尔马林固定使抗体更容易结合,这可能与这两种固定剂对抗原的作用不同有关[10],王璇等[11]通过对比不同的固定剂用于免疫组化染色后也认为含有甲醛的固定液优于其他固定液,这可能是因为甲醛可使蛋白质分子之间发生交联,易于抗原与抗体结合。因此,笔者认为对于固定剂的选择可以因人、因实验室的条件来定,但中性缓冲福尔马林在制作铺片上更有优势,对于抗原修复时担心掉片的实验者,建议使用丙酮固定,因为丙酮保存抗原的免疫活性较好[12]。
综上所述,用中性缓冲福尔马林固定至少24 h后即可在显微镜下完整剥离出用于显示阴道神经与血管的肌层组织,可以对其进行各种组织形态学的染色,这将为后期研究由阴道神经血管引起的相关病变提供重要方法,成为研究阴道疾病的新技术。