miR-499a-5p通过靶向TLR2抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激和凋亡

杨伟，王雁，李俊杰，王燕琼，陈文栋

(昆明医科大学第一附属医院麻醉科，云南 昆明 650032)

急性心肌梗死是临床上常见的心血管疾病，由于冠状动脉内斑块破裂、血栓形成导致冠状动脉血管闭塞、心肌细胞缺血缺氧损害[1]。然而心肌细胞在长时间缺血缺氧状态下可导致细胞内线粒体功能障碍，启动氧化应激反应，激活细胞凋亡途径，最终引起心肌细胞损害[2]。因此，抑制氧化应激反应、降低心肌细胞凋亡率对减轻心肌细胞缺血缺氧损伤的具有重要意义。近年来，微小RNA(miRNA)在人类疾病中的作用已经逐渐受到大量研究的认可，尤其在心血管疾病中的作用[3]。Zhu等[4]指出，miR-499a-5p下调可能与心肌细胞缺氧发生氧化应激反应，并诱导心肌细胞凋亡途径相关，然而其具体作用靶点研究尚未完善。Toll样受体2(Toll-like receptors 2，TLR2)是一种参与非特异性免疫的蛋白分子，其通过识别不同病原体相关分子模式，激动信号级联反应，进而促进免疫应答[5]。Zhang等[6]指出，miR-499可能参与IPostC的心脏保护，通过抑制局部和全身TLR2激活、炎症和PKC信号传导。因此，本研究拟探讨miR-499a-5p与TLR2的靶向关系，并分析其对缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠心肌细胞H9c2(购自北京北纳创联生物公司)；杜氏细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(购自Hyclone公司)；pGL3-Basic质粒载体(购自上海康朗生物科技有限公司)；脂质体Lipofectamine3000(购自Invitrogen公司)；实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒(购自日本TaKaRa公司)；B淋巴细胞瘤因子2XL(Bcl2-xL)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的第一抗体(购自abcam公司)，丙二醛(MDA)(S0131S)、超氧化物歧化酶(SOD)(S0103)、活性氧(ROS)(PS835)试剂盒、双荧光素酶报告基因、miR-499表达检测试剂盒(均购自上海碧云天研究所)；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素-碘化丙啶(V-FITC/P1)凋亡检测试剂盒(购自南京森贝伽生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养、模型建立及分组干预

将H9c2细胞株置于5%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基进行常规培养传代，取对数期心肌细胞进行分组干预，每组干预条件重复5次：(1)对照组心肌细胞置于常氧培养箱中传代培养；(2)将其余细胞置于1% O2、94% N2、5% CO2条件下缺氧处理3 h，在37 ℃ 5% CO2条件下复氧培养6 h，制造缺氧/复氧模型细胞，设为模型组；根据实验设计情况，将细胞分为miR-NC组、miR-499a-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-499a-5p组、miR-499a-5p+pGL3-Basic组、miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2组。将miR-NC、miR-499a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-499a-5p、miR-499a-5p+pGL3-Basic、miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2按照1∶3量加入脂质体试剂，混匀转染至模型组心肌细胞H9c2，转染5 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h后，对各培养基采样进行qRT-PCR，确认转染是否成功。

1.3 qRT-PCR检测细胞中miR-499a-5p、TLR2mRNA的表达[7]

收集各组细胞，用Trizol法提取细胞中RNA，采用逆转录试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)合成cDNA，反应体系5 μL(5×Prime Script RT Master MiX 2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL)，轻柔混匀后进行加入DNA扩增仪中。反应条件为：37 ℃ 15 min反转录，85 ℃ 5 s反转录酶失活后，4 ℃保存。最后采用qRT-PCR试剂盒对cDNA中的miR-499a-5p、TLR2 mRNA进行荧光定量PCR，qRT-PCR反应体系20 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ (2×) 10 μL、PCR正反向引物(10 μM)各0.8 μL、 ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、cDNA 2 μL、灭菌蒸馏水6 μL,进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 120 s，95 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，共进行40次循环。最终在软件中生成PCR循环曲线及循环阈值(Ct)，以GAPDH为内参，以2-△△Ct计算miR-499a-5p、TLR2 mRNA的表达量。见表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot检测细胞中TLR2、Bcl-xL、Bax、Caspase-3的蛋白表达

收集各组H9c2细胞，加入RIPA蛋白裂解使其充分裂解后，提取细胞中的总蛋白；将蛋白质置于在100 ℃沸水中变性10 min，取上清液进行蛋白电泳上样；采用转膜仪将上样蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，转膜完成后用5%脱脂牛奶封闭处理2 h，而后在一抗 [包括兔抗TLR2(abcam，ab209216)、兔抗Bcl-xL(abcam，ab32370)、兔抗Bax(abcam，ab32503)、兔抗Caspase-3(abcam，ab32351)] 溶液中以4 ℃处理过夜；次日取膜洗净后置于二抗溶液中，37 ℃孵育2 h；最后在凝胶仪中曝光得到蛋白条带，根据蛋白条带灰度值计算蛋白的相对表达量。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组H9c2细胞，将细胞接种在6孔板内，严格按照V-FITC/P1凋亡试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)说明书操作，取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-APC混匀后于室温避光孵育5 min。加入10 μL的碘化丙啶(PI)20 μg/mL，并加400 μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，立刻进行流式检测。流式细胞仪检测时，Annexin V-APC用633 nm激发器激发，最大发射波长660 nm，建议使用FL4或RL1通道检测。凋亡率(%)=早期凋亡(%)+晚期凋亡(%)

1.6 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞中ROS、SOD、MDA含量

收集各组H9c2细胞，弃去培养液加入染色工作液于37 ℃孵育40 min，PBS缓冲液洗脱后，严格遵循试剂盒说明书操作步骤，完成一抗反应、二抗结合、底物制备及显色，最后将样本直接置于酶标仪中读取吸光度(波长405～450 nm)并计算MDA(碧云天)、SOD(碧云天)和ROS(碧云天)含量。每个样本做3个复孔，上述实验重复3次取均值。

1.7 双荧光素报告基因检测[8]

通过使用Rnahybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)生物信息学数据库检索miR-499a-5p靶向目的基因TLR2的结合位点。在H9c2细胞中构建双荧光素酶基因报告分析。使用PCR扩增TLR2的野生型 (WT)3′-UTR序列，并将其克隆到pmirGLO载体中，采用点突变法扩增TLR2突变株 (MUT)3′-UTR序列，并克隆到pmirGLO载体中，建立荧光素酶报告质粒。再将已载入基因片段的pGL3-Basic与脂质体混合分别与miR-NC、miR-499a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-499a-5p共同转染至H9c2细胞。以每孔100 μL的量加入细胞悬液，缓慢摇15 min后，将细胞裂解液吸至1.5 mL离心管，4 ℃ 12 000 rpm离心10 min，取上清液，96孔板中加入Luciferase Assay ReagentⅡ (LARⅡ)工作液100 μL，加入20 μL细胞裂解液，测定记录内参(firefly luciferase，Fl)值。加入100 μL Stop&Glo Reagent，测定记录Renilla luciferase (Rl)值，即为报告基因发光值。上述操作严格遵从双荧光素酶报告基因测试试剂盒(碧云天)说明书。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 miR-499a-5p及TLR2在A/R模型H9c2细胞中的表达

与对照组相比，模型组TLR2蛋白的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-NC组相比，miR-499a-5p组TLR2蛋白表达降低，anti-miR-499a-5p组TLR2蛋白表达升高，anti-miR-499a-5p组TLR2蛋白表达水平高于miR-499a-5p组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

与对照组相比，模型组miR-499a-5p低表达，差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-NC组相比，miR-499a-5p组高表达，anti-miR-499a-5p组低表达，miR-499a-5p组与anti-miR-NC组相比呈高表达，上述差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.2 过表达miR-499a-5p对A/R模型H9c2细胞氧化应激及凋亡的影响

与miR-NC组相比，miR-499a-5p组细胞凋亡率下降，Bax、Caspase-3低表达，Bcl-xL高表达，ROS、MDA含量降低，SOD水平升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3及图4。

2.3 过表达TLR2对A/R模型H9c2细胞氧化应激及凋亡的影响

与miR-499a-5p+pGL3-Basic组相比，miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2组细胞中细胞凋亡率上升，Bax、Caspase-3高表达，Bcl-xL低表达，ROS、MDA含量上升，SOD水平下降，上述差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5及图6。

2.4 miR-499a-5p靶向TLR2

与miR-499a-5p+pGL3-Basic组比较，miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2组TLR2-WT细胞荧光活性降低(t=14.393，P<0.001)，TLR2蛋白呈低表达(t=16.042，P<0.001)；与anti-miR-499a-5p+pGL3-Basic组比较，anti-miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2组TLR2-WT细胞荧光活性上升(t=6.227，P<0.001)，TLR2蛋白表达呈高表达(t=8.697，P<0.001)，可见，miR-499a-5p靶向作用于TLR2的表达。见表2。

表2 miR-499a-5p靶向

3 讨论

本研究通过建立缺氧/复氧模型，观察模型心肌细胞与正常心肌细胞时发现，模型细胞内miR-499a-5p呈低表达，TLR2蛋白高表达；在模型内各组比较中发现，与miR-NC组相比，miR-499a-5p组miR-499a-5p呈高表达，而anti-miR-499a-5p呈低表达，而TLR2的表达则与miR-499a-5p表达相反；在观察过表达miR-499a-5p或过表达TLR2时发现，与氧化应激及细胞凋亡相关蛋白表达时呈现相反的趋势。

国外一项临床研究报告[9]显示，发生不稳定型心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死患者发病后3 h内血清miR-499a-5p表达水平降低，提示miR-499a-5p可能与心肌细胞损伤有关，但其对心肌细胞的作用机制及靶基因研究尚不明确。Zhao等[10]通过制造缺氧/复氧模型研究指出，miR-499a-5p在心肌细胞中表达显著降低，而过表达miR-499a-5p后心肌细胞的凋亡率下降；而另一相关研究[6]指出，miR-499a-5p通过抑制缺血再灌注模型中TLR2信号传导，抑制如白细胞介素-6、白细胞介素-1β等促炎细胞因子的级联反应，发挥对心肌细胞的保护作用。TLR2是近年来缺血再灌注损伤及心肌保护作用的新兴治疗靶点，此前的基础研究[11-12]指出，通过抑制TLR2的激活，可明显降低心肌梗塞面积及局部和全身炎症细胞，而单核细胞中TLR2的表达水平或可作为心肌损伤程度的参考指标。虽然以往研究确立了miR-499a-5p对心肌细胞的作用及其可能与抑制TLR2表达相关，但对于缺氧/复氧心肌细胞的作用及miR-499a-5p与TLR2二者之间的靶向关系研究尚不明确。本研究通过观察H9c2A/R模型细胞发现，与正常H9c2细胞相比，A/R模型细胞内miR-499a-5p低表达，TLR2却呈高表达，这与上述研究基本一致。在通过进一步对比miR-499a-5p、miR-NC、anti-miR-499a-5p、anti-miR-NC中发现，在miR-499a-5p降低的组别中，TLR2均呈高表达，而在miR-499a-5p升高的组别中，TLR2均呈低表达，因此二者之间可能存在负调控关系。

在进一步研究H9c2细胞凋亡率时发现，miR-499a-5p过表达组凋亡率均低于对照组，而TLR2过表达组凋亡率均高于对照组。心肌细胞在缺氧条件下会发生线粒体功能障碍，线粒体内细胞色素C(Cyt-C)激活并被释放入胞质，通过级联反应激活Caspase-3蛋白并启动线粒体凋亡程序[13-14]。Bcl-xL和Bax是一对负责调控线粒体膜上Cyt-C的蛋白分子，Bax蛋白可增加Cyt-C的释放，促进凋亡作用，而Bcl-xL蛋白作用与其正好相反[15-16]。本研究通过对各模型组细胞进行Western blot检验，对比上述参与细胞凋亡的相关蛋白水平发现，与miR-NC组相比，miR-499a-5p组上调Bcl-xL蛋白表达，而Bax及Caspase-3蛋白均表达下调，而过表达TLR2的miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2组下调Bcl-xL蛋白表达，而Bax及Caspase-3蛋白均表达上调。此外，在进行心肌细胞凋亡研究的同时，采用ELISA法检测心肌细胞中ROS、SOD及MDA的水平，结果显示，过表达miR-499a-5p的组别中ROS及MDA水平明显降低，SOD水平升高，而过表达TLR2的组别中，ROS及MDA水平明显上升，SOD水平降低，这结果与细胞凋亡率及其相关蛋白表达量波动情况相互吻合。另外，双荧光素报告基因检测结果显示，miR-499a-5p与TLR2确实存在靶向关系。因此，miR-499a-5p一方面可能通过靶向下调TLR2的表达，抑制TLR2对免疫应答的作用，减少促炎细胞的累积及炎症因子对心肌细胞的破坏，降低氧化应激反应程度，从而发挥保护心肌细胞的作用；另一方面，miR-499a-5p通过抑制Bax、Caspase-3蛋白的表达，上调Bcl-xL蛋白的表达，抑制心肌线粒体启动凋亡程序，进而降低心肌细胞凋亡率，减轻损伤程度。

综上，miR-499a-5p与TLR2为靶向关系，可能通过抑制局部和全身 TLR2 激活，降低心肌细胞凋亡率及氧化应激反应，发挥保护心肌细胞的作用。