清血毒胶囊对银屑病模型小鼠的治疗效果及皮损部HDAC1、Gli1蛋白表达的影响*

胡丽霞，刘 巧，郎 璇

（1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.江西中医药大学第二附属医院，江西 南昌 330012）

银屑病是以角质形成细胞过度增殖、炎症细胞浸润为主要病理表现的慢性炎症性皮肤病。遗传与环境因素之间的相互作用是导致发病的主要原因之一。表观遗传修饰是在不改变DNA序列的情况下，通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等调节基因表达，其可能是银屑病发病机理中遗传和环境因素之间相互作用的关键环节[1]。研究表明，组蛋白脱乙酰基酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）调控核转录因子胶质瘤相关癌基因同源物（glioma-associated oncogene homolog，Gli）去乙酰化能激活Hedgehog（Hh）信号通路[2]。Gli1是Hh信号通路的关键转录因子，其激活后可靶向调控下游基因，促进细胞增殖[3-4]。因此，通过靶向调节组蛋白去乙酰化酶，调控角质形成细胞增殖是治疗银屑病的有效方式之一。但这类组蛋白抑制剂不能靶向特定器官，因此具有一定的副作用。

中医治疗银屑病历史悠久，且效果显著。刘巧总结多年临床经验，认为银屑病的病位在“血分”，病因为“毒邪”，而“毒邪”源于饮食、环境等因素，这与表观遗传因素介导环境因素参与银屑病发病的现代医学理论相契合；其根据“毒邪理论”组方，制成中成药清血毒胶囊[5]。前期临床研究表明，本药治疗银屑病疗效显著，且无明显副作用[6]，但其作用机制尚需探究。本研究通过观察清血毒胶囊对银屑病模型小鼠治疗效果及HDAC1、Gli1表达的影响，旨在探究本药干预银屑病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物6周龄雄性健康BALB/c小鼠60只，SPF级，体质量18～20 g，由斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。饲养于江西中医药大学实验动物中心动物房，温度20～25℃，湿度40%～60%，12 h/12 h明暗交替环境，常规喂养，动物实验伦理批号：JZSYDWLL2020-0528。整个实验过程中对动物的各种处理均遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的相关规定。

1.2 药物与试剂 清血毒胶囊（批号：20191107，规格：0.25g/粒）购自海南省皮肤病医院；甲氨蝶呤片（批号：190401，规格：0.25 mg/粒）购自通化茂祥制药有限公司；咪喹莫特软膏（批号：H20030129）购自明欣药业有限公司；Gli1Rabbit pAb（批号：EPR4523）购自abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号：0104）购自BIOMIGA公司；超敏化学发光试剂盒（批号：IS0709）购自苏州优逸兰迪生物科技有限公司；HDAC1 Rabbit pAb（批号：0081210201）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（批号：9300014001）均购自ABcolnal公司；Trizon Reagent（批号：CW0580S）、Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒（批号：CW0581M）、HiScriptRII Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)（批号：R223-01）均购自康为世纪公司。

1.3 主要仪器RM 2255型石蜡切片机（德国Leica公司）；D 1008 E型微型离心机（美国赛洛捷克公司）；酶标仪（美国Thermofisher）；XH-C型旋涡混合器（常州越新仪器制造有限公司）；GL-150型干式电加热器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；TGL-16 G型低温高速离心机（常州中捷实验仪器制造有限公司）；XSP-17C型荧光相差显微镜（Leica公司）；VE-186型直立转移电泳槽（Tanon）；CL750型凝胶成像仪（ProteinSimple）。

1.4 造模与分组 适应性喂养7 d后，按随机数字表法将小鼠分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组、清血毒胶囊低剂量组、清血毒胶囊中剂量组、清血毒胶囊高剂量组，每组10只。除空白组外，其余各组小鼠制备银屑病模型：采用电动剃毛刀剃毛（剃毛面积3 cm×3 cm），每天用棉签涂抹5%咪喹模特软膏（42 mg/只），1次/d，连续外涂7 d。造模成功小鼠背部皮肤可见鳞屑、红斑及皮肤增厚等症状。空白组小鼠背部涂抹等量凡士林乳膏。

1.5 实验给药 造模同时予治疗药物干预。给药剂量参照人与动物体表面积换算公式计算（70 kg与20 g小鼠等效剂量比值为0.0026）[7]。清血毒胶囊成人剂量为3 g/d，甲氨蝶呤成人剂量为5 mg/d。清血毒胶囊低、中、高剂量组小鼠分别给予清血毒胶囊混悬液灌胃，0.195、0.39、0.78 g/（kg·d），2次/d，连续给药7d。甲氨蝶呤组小鼠给予甲氨蝶呤溶液灌胃，0.65 mg/（kg·d），2次/d，连续给药7 d。空白组和模型组小鼠给予等量生理盐水灌胃，2次/d，连续给药7 d。

1.6 观察指标

1.6.1 小鼠皮损PASI评分 每天观察并记录各组小鼠的皮损颜色、鳞屑程度、皮肤厚度，并进行银屑病皮损严重程度指数评分（psoriasis area and severity index，PASI）。具体评分项目包括红斑颜色、鳞屑覆盖面积、斑块厚度。（1）红斑颜色：无红斑，计0分；有轻微红斑，计1分；有中度红斑，计2分；有重度红斑，计3分；有极重度红斑，计4分。（2）鳞屑覆盖面积：无鳞屑覆盖，计0分；有散在细鳞屑覆盖，计1分；大部皮损部有鳞屑覆盖，计2分；全部皮损有鳞屑覆盖，计3分；整体皮肤为皮损，计4分。（3）斑块厚度：正常皮肤，计0分；皮损轻微高出正常皮肤，计1分；皮损微隆，计2分；皮损肥厚，计3分；整体皮肤皮损，计4分。各项指标的得分加权为PASI评分[8]。

1.6.2 HE染色检测小鼠皮肤组织病理学变化 末次给药结束后，予5%水合氯醛溶液麻醉，取小鼠皮肤组织1 cm×1 cm，于中性甲醛固定，剩余组织于-80℃冰箱冻存。皮肤组织病理切片制作：皮肤组织固定24 h后，自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片，烤片，二甲苯脱蜡，依次浸于无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、自来水水化，苏木精核染，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）返蓝，伊红复染，脱水透明，封片。镜下观察切片，参照文献[9]评分标准，予Baker法组织学评分。

1.6.3 Western blotting检测小鼠皮损部HDAC1和Gli1蛋白含量 取小鼠皮损组织，称重后剪碎（冰盒上操作），置于EP管，加裂解液和蛋白抑制剂，加预冷钢珠匀浆，离心，取上清，5×稀释，参照BCA试剂盒测蛋白浓度；剩余上清液按4∶1的比例加loading buffer缓冲液，煮沸，500 μL/管分装，-80℃冻存。蛋白浓度测定后，取适量组织蛋白电泳。电泳步骤：制备分离胶和浓缩胶，注入玻璃板，插入梳子，待胶凝固，取出梳子，上样，注入电泳液电泳，截取目的蛋白的凝胶，转膜，5%牛奶封闭，TBST洗膜，一抗孵育过夜，TBST洗膜，二抗孵育，TBST洗膜，显影，测目的蛋白。采用Image J软件分析蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料用“均数±标准差”（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；非正态分布计量资料采用非参数秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠背部皮肤症状比较 干预结束后，空白组小鼠背部皮肤无红斑、鳞屑等症状，皮肤厚度正常；模型组小鼠背部皮肤出现明显红斑、鳞屑和皮肤增厚等症状；甲氨蝶呤组小鼠背部皮肤可见少量鳞屑，无明显红斑，无明显皮肤增厚症状；清血毒胶囊低剂量组小鼠背部皮肤可见少量鳞屑覆盖，伴有红斑，皮肤轻度增厚；清血毒胶囊中剂量组小鼠背部皮肤可见少量鳞屑，无明显皮肤增厚，可见少量红斑；清血毒胶囊高剂量组小鼠背部皮肤可见少量鳞屑，无明显红斑，无明显皮肤增厚。（见图1）

图1 各组小鼠皮损症状比较

2.2 各组小鼠PASI评分比较 除空白组外，其余各组大鼠的PASI评分均随时间的延长（第1天、第3天、第7天）而逐渐升高，差异有统计学意义（P<0.05），即存在时间效应。6组小鼠PASI评分总体比较，差异有统计学意义（P<0.05），即存在分组效应。干预第1天，与空白组比较，模型组和清血毒胶囊低、中剂量组小鼠PASI评分明显升高（P<0.05），甲氨蝶呤和清血毒胶囊高剂量组小鼠PASI评分与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，甲氨蝶呤组和清血毒胶囊高剂量组小鼠PASI评分明显降低（P<0.05）；清血毒胶囊低、中、高剂量组小鼠PASI评分与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；清血毒胶囊中、高剂量组小鼠PASI评分与清血毒胶囊低剂量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；清血毒胶囊高剂量组小鼠PASI评分与清血毒胶囊中剂量组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。干预第3天，与空白组比较，模型组、甲氨蝶呤组和清血毒胶囊低、中、高剂量组小鼠PASI评分均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，甲氨蝶呤组和清血毒胶囊中、高剂量组小鼠PASI评分明显降低（P<0.05）；与甲氨蝶呤组比较，清血毒胶囊低、中剂量组小鼠PASI评分明显升高（P<0.05）；与清血毒胶囊低剂量组比较，清血毒胶囊中、高剂量组小鼠PASI评分明显降低（P<0.05）；与清血毒胶囊中剂量组比较，清血毒胶囊高剂量组小鼠PASI评分明显降低（P<0.05）。干预第7天，与空白组比较，模型组、甲氨蝶呤组和清血毒胶囊低、中、高剂量组小鼠PASI评分均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，甲氨蝶呤组和清血毒胶囊中、高剂量组小鼠PASI评分均明显降低（P<0.05）；与甲氨蝶呤组比较，清血毒胶囊中、低剂量组小鼠PASI评分明显升高（P<0.05）；与清血毒胶囊低剂量组比较，清血毒胶囊中、高剂量组小鼠PASI评分均明显降低（P<0.05）；与清血毒胶囊中剂量组比较，清血毒胶囊高剂量组小鼠PASI评分明显降低（P<0.05）。时间因素和组别因素存在交互效应（P<0.05）。（见图2、表1）

表1 各组小鼠PASI评分比较（±s，分）

表1 各组小鼠PASI评分比较（±s，分）

注：F时间主效应=2.081，P时间主效应=0.000；F分组主效应=335.283，P分组主效应=0.000；F交互效应=126.638，P交互效应=0.000；与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与甲氨蝶呤组比较，cP<0.05；与清血毒胶囊低剂量组比较，dP<0.05；与清血毒胶囊中剂量组比较，eP<0.05；与第1天比较，fP<0.05；与第3天比较，gP<0.05

组别 动物数（只） 给药剂量[mg/（kg·d）]第1天 第3天 第7天 F P空白组 10 - 0±0 0±0 0±0模型组 10 - 1.40±0.52a c 1.90±0.31ac 8.50±0.52acfg 731.017 0.000甲氨蝶呤组 10 0.65 0.60±0.52b 0.80±0.42abd 4.20±0.42abfg 197.357 0.000清血毒胶囊低剂量组 10 195.00 1.20±0.42a 1.80±0.42acf 8.40±0.52acfg 769.500 0.000清血毒胶囊中剂量组 10 390.00 0.80±0.42a 1.40±0.52af 5.90±0.57abcdfg 304.043 0.000清血毒胶囊高剂量组 10 780.00 0.77±0.62b 0.90±0.32abd 4.30±0.48abdefg 211.167 0.000 F 12.808 37.265 376.518 P 0.000 0.000 0.000

图2 各组小鼠PASI评分交互效应轮廓图

2.3 各组小鼠皮肤组织的病理变化比较 空白组小鼠表皮无增厚，无鳞屑，无明显炎症细胞浸润，无表皮突延长，无角质形成细胞角化不全等病理表现；模型组小鼠表皮明显增厚，脱屑明显、局部可见角化不全细胞，表皮突向下延长，真皮层可见炎症细胞浸润；甲氨蝶呤组小鼠表皮略见增厚，有少许鳞屑，炎症细胞浸润明显减少，表皮突明显变短；清血毒胶囊低剂量组小鼠表皮增厚明显，表皮突明显延长，可见明显脱屑，伴有炎症细胞浸润；清血毒胶囊中剂量组小鼠表皮明显变薄，表皮突变短，可见少量鳞屑脱落，伴有角化不全和角化过度细胞；清血毒胶囊高剂量组小鼠表皮增厚明显减轻，无明显炎症细胞浸润，表皮突明显变短，无鳞屑。（见图3）

图3 各组小鼠皮肤组织病理变化情况（HE，×100）

2.4 各组小鼠Baker法评分比较 与空白组比较，模型组小鼠Baker法评分明显升高（P<0.05）。与模型组比较，甲氨蝶呤组和清血毒胶囊中、高剂量组小鼠Baker法评分均明显降低（P<0.05）；清血毒胶囊低剂量组小鼠Baker法评分与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与甲氨蝶呤组比较，清血毒胶囊中、低剂量组小鼠Baker法评分均明显升高（P<0.05）；清血毒胶囊高剂量组小鼠Baker法评分与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与清血毒胶囊低剂量组比较，清血毒胶囊中、高剂量组小鼠Baker法评分均明显降低（P<0.05）。与清血毒胶囊中剂量组比较，清血毒胶囊高剂量组小鼠Baker法评分明显降低（P<0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠的Baker评分比较（±s，分）

表2 各组小鼠的Baker评分比较（±s，分）

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与甲氨蝶呤组比较，cP<0.05；与清血毒胶囊低剂量组比较，dP<0.05；与清血毒胶囊中剂量组比较，eP<0.05

组别 动物数（只）给药剂量[mg/（kg·d）]Baker评分空白组 10 - 0.15±0.24模型组 10 - 6.40±0.66a甲氨蝶呤组 10 0.65 1.60±0.52ab清血毒胶囊低剂量组10 195.00 6.30±0.35ac清血毒胶囊中剂量组10 390.00 4.90±0.52abcd清血毒胶囊高剂量组10 780.00 2.05±0.69abde F 260.672 P 0.000

2.4 各组小鼠皮肤组织HDAC1和Gli1蛋白表达比较 与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织Gli1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，甲氨蝶呤组和清血毒胶囊低、中、高剂量组小鼠皮肤组织Gli1蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05），且4组间小鼠皮肤组织Gli1蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织HDAC1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，甲氨蝶呤组和清血毒胶囊中、高剂量组小鼠皮肤组织HDAC1蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）；与甲氨蝶呤组比较，清血毒胶囊高剂量组小鼠皮肤组织HDAC1蛋白相对表达量明显降低（P<0.05），清血毒胶囊低剂量组小鼠皮肤组织HDAC1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）；清血毒胶囊高剂量组小鼠皮肤组织HDAC1蛋白相对表达量明显低于清血毒胶囊中、高剂量组（P<0.05）。（见图4、表4）

图4 各组小鼠皮肤组织HDAC1、Gli1蛋白表达Western blotting图

表4 各组小鼠皮肤组织HDAC1、Gli1蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组小鼠皮肤组织HDAC1、Gli1蛋白相对表达量比较（±s）

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与甲胺蝶呤组比较，cP<0.05；与清血毒胶囊低剂量组比较，dP<0.05；与清血毒胶囊中剂量组比较，eP<0.05

分组 动物数（只）给药剂量[mg/(kg·d）] HDAC1 Gli1空白组 10 - 0.57±0.15 0.44±0.13模型组 10 - 0.88±0.16a 0.71±0.20a甲氨蝶呤组 10 0.65 0.56±0.07b 0.42±0.12b清血毒胶囊低剂量组10 195.00 0.76±0.10c 0.31±0.09b清血毒胶囊中剂量组10 390.00 0.59±0.05b 0.36±0.12b清血毒胶囊高剂量组10 780.00 0.37±0.03abcde 0.27±0.15b F 8.207 3.681 P 0.001 0.030

3 讨论

银屑病患者皮损中存在真皮和表皮免疫细胞浸润，以及表皮角质形成细胞过度增生等病理表现，临床表现为连续、反复出现的鳞屑脱落及局部炎症的难以消退[10]。本研究结果显示，银屑病模型小鼠表皮明显增厚，脱屑明显，局部可见角化不全细胞，表皮细胞角化过度明显，表皮突向下延长，真皮层可见炎症细胞浸润，PASI评分、Baker法评分均显著升高（P<0.05），说明银屑病小鼠造模成功。

本课题组前期研究发现，清血毒胶囊具有抑制银屑病小鼠角质形成细胞增殖的作用[11]。本研究结果显示，经清血毒胶囊治疗后，银屑病小鼠的PASI评分和Baker法评分均明显降低（P<0.05）。再次证实清血毒胶囊干预银屑病疗效肯定，且其治疗效果与干预时间和药物浓度相关。

Hedgehog信号通路由NÜSSLEIN-VOLHARD C和WIESCHAUS E在果蝇中首次发现[12]，该通路对胚胎发育和组织再生具有重要作用[13]。研究[3-4]表明，Hedgehog途径参与细胞存活、增殖和上皮-间充质转换等细胞生理过程。最近的研究[14]表明，Hedgehog信号的异常激活，可能会诱导角质形成细胞过度增殖和异常分化。且有研究[15]证实，阻断Hedgehog通路能抑制HaCaT细胞的增殖能力和抑制炎症细胞因子的表达。本实验结果也显示，银屑病模型小鼠Gli1的蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）。清血毒胶囊低、中、高剂量组小鼠皮损部Gli1蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）。由此可见，清血毒胶囊对银屑病皮损部Gli1蛋白表达具有显著抑制作用，且其抑制作用与药物浓度相关。

邵依等[16]研究表明银屑病皮损组织中HDAC1表达明显升高。HWANG Y J等[17]也发现斑块状银屑病患者皮损中HDAC1的含量明显高于健康人。因此，抑制HDAC1的表达，干预非经典通路调控Gli1的去乙酰化修饰，阻断Hedgehog活性，可能是干预银屑病的作用机制。本研究结果表明，清血毒胶囊中、高剂量组小鼠皮损部HDAC1蛋白表达均明显降低（P<0.05）。由此可见，清血毒胶囊对银屑病小鼠皮损部HDAC1蛋白表达具有显著抑制作用，且其抑制作用随药物浓度的升高逐渐增强。

综上所述，清血毒胶囊具有改善银屑病小鼠皮损部病理变化，抑制HDAC1、Gli1蛋白表达的作用，其机制可能是通过抑制HDAC1、Gli1蛋白表达，调控下游靶基因，从而抑制角质形成细胞增殖，发挥干预银屑病的作用。本研究下一步将采用细胞实验，通过抑制或过表达HDAC1，深入探究清血毒胶囊对HDAC1表达、Gli1去乙酰化的影响。