补肾通络方对去势大鼠骨质疏松症模型子宫内膜和骨量流失的影响*

凌家艳，刘 庆，马 威，薛 莎

（1.武汉市第一医院，湖北 武汉 430030；2.湖北省中医院，湖北 武汉 430061）

骨质疏松症是以骨密度及骨质量下降、骨微结构改变等为主要表现，导致骨脆性增加、骨折及全身性骨病发生的一类与年龄相关的代谢性疾病[1]。绝经后女性因卵巢功能衰退，雌激素水平下降，导致骨量下降，易发绝经后骨质疏松症。骨质疏松症可导致驼背、骨痛，甚至骨质疏松性骨折。流行病学调查显示年龄超过50岁的人群骨质疏松症患病率为19.2%，年龄超过60岁的人群患病率超过30%[2]。研究预测，至2050年，我国骨质疏松性骨折人数将达599万[3]，将会对个体及社会造成严重的经济负担。近年来，越来越多的研究表明Wnt通路是研究骨质疏松症治疗方法极为有效的通路之一[4]。补肾中药可通过调节骨吸收与骨形成平衡，减少激素水平降低造成的骨高转换，提高骨密度，减少骨量丢失[5-6]。补肾通络方是我院名老中医经验方，能改善骨质疏松症状，提高骨密度。本研究主要通过观察该方对去势骨质疏松症模型大鼠第四腰椎骨密度和骨微结构，血清雌激素、卵泡刺激素、黄体生成素水平，以及子宫内膜Wnt/β-catenin信号通路的影响，探讨该方治疗绝经后骨质疏松症的作用机制，为其临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物4个月龄健康SPF级雌性SD大鼠40只，体质量270～300 g，购自湖北省实验物研究中心，动物合格证编号：No.42000600017472，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。饲养室温度控制于22～26℃，空气湿度40%～50%，自由进食饮水，12 h间隔照明，适应性喂养1周。实验方案经武汉市第一医院伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 补肾通络方，方药组成：淫羊藿15 g，杜仲10 g，川牛膝10 g，黄芪10 g，生地黄10 g，丹参10 g，鸡血藤15 g。以上药材均购于湖北天济中药饮片有限公司。补肾通络方按照常规方法煎煮，浓缩至生药质量浓度为1.44 g/mL，放置4℃冰箱保存备用。戊酸雌二醇片（注册证号J20130009，规格：1 mg）购于法国Delpharm Lille SAS公司，制备成水溶液，质量浓度为0.009mg/mL。雌二醇（E2）ELISA试剂盒（批号：C0102210102）、卵泡刺激素（FSH）ELISA试剂盒（批号：C0109460150）、黄体生成素（LH）ELISA试剂盒（批号：C0108460149）均购自华美公司；β-catenin试剂盒（批号：GB11015）、ERα试剂盒（批号：GB13205）均购自赛维尔公司。

1.3 主要仪器PL-203型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）公司]；BR4i型台式离心机（法国JOUAN公司）；Epoch型酶标仪（美国BioTek公司）；Donatello型脱水机（意大利DIAPATH公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；uCT50型Micro-CT（瑞士SCANCO公司）。

1.4 造模与分组 适应性喂养1周后，将40只大鼠按随机数字表法分为假手术组（8只）和造模组（32只）。参照文献[7]造模，造模组大鼠禁食不禁水12 h，经腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，腹部去毛，逐层切开，进入腹腔，切除双侧卵巢。假手术组大鼠切除卵巢周围少量脂肪组织。术后肌内注射青霉素3 d。1周后连续5 d行阴道涂片检查，无周期性变化表明去势成功。全部造模成功后，将造模成功大鼠随机分为模型组、戊酸雌二醇组、补肾通络方高剂量组、补肾通络方低剂量组，每组8只。

1.5 实验给药 各组药物剂量按照人鼠体表面积法[8]进行折算。戊酸雌二醇组按0.09 mg/kg灌胃，补肾通络方高、低剂量组分别按14.4、7.2 g/kg灌胃。各药物组按1 mL/100 g体质量给予相应的药物灌胃，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃。1次/d，连续给药3个月。

1.6 观察指标

1.6.1 性激素 末次给药后24 h，大鼠麻醉后心脏取血，3000 r/min离心10 min后分离得到血清。ELISA法检测血清E2、FSH、LH水平。

1.6.2 micro-CT检测 将各组大鼠完整的第四腰椎置于micro-CT系统上进行扫描，应用自带软件进行骨密度测定和骨组织形态学计量分析，包括骨体积分数（BV/TV）、骨表面积和骨体积的比例（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁数量（Tb.N）。

1.6.3 子宫内膜HE染色 将大鼠子宫投入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，酒精中脱水，常规石蜡包埋，进行组织切片，厚度为5 μm。常规苏木素-伊红染色、中性树胶封片后，光镜下观察子宫内膜形态学变化。

1.6.4 子宫内膜ERα、β-catenin免疫组化检测 分离出大鼠子宫内膜，4%多聚甲醛溶液固定1 d，常规石蜡包埋、切片。室温封闭30 min，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜；PBS洗涤后滴加稀释好的二抗，37℃孵育30 min。PBS清洗后，DAB避光显色，镜下观察直到棕黄色阳性结果出现。水洗、苏木素复染、脱水、中性树胶封片。以细胞膜或细胞浆着色为棕黄色定为阳性细胞。应用Image-Pro Plus6.0图像分析软件系统，每张切片选择5个视野拍照，计算每组标本切片中平均光密度值（mean optical density，MOD）。

1.7 统计学方法 采用SPSS 27.0统计软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett’s T3法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清E2、FSH、LH水平比较 模型组大鼠血清E2含量低于假手术组（P＜0.05），FSH、LH水平高于假手术组（P<0.05），表明去势成功。补肾通络方高、低剂量组和戊酸雌二醇组大鼠血清E2含量均明显高于模型组（P<0.05），FSH、LH水平均明显低于模型组（P<0.05）；补肾通络方高、低剂量组大鼠血清E2、FSH、LH水平与戊酸雌二醇组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠血清E2、FSH、LH水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清E2、FSH、LH水平比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量 E2（pg/mL) FSH（IU/L） LH（IU/L）假手术组 8 - 124.084±11.72118.550±7.8410.823±0.286模型组 8 - 98.086±7.283a 34.181±6.876a 1.666±0.602a补肾通络方高剂量组8 14.40 g/kg 114.241±18.314b 20.658±7.437b 0.949±0.410b补肾通络方低剂量组8 7.20 g/kg 112.569±13.982b 22.460±12.827b 0.983±0.369b戊酸雌二醇组 8 0.09 mg/kg 118.538±11.489b 19.030±7.620b 0.818±0.269b F 4.411 4.303 6.092 P 0.000 0.006 0.000

2.2 各组大鼠第四腰椎骨密度及骨微结构比较 与假手术组比较，模型组大鼠骨密度、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）均明显降低（P＜0.05），骨表面积和骨体积的比例（BS/BV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，补肾通络方高、低剂量组和戊酸雌二醇组大鼠骨密度、BV/TV均明显升高（P＜0.05），Tb.Sp均明显降低（P<0.05）；与模型组比较，补肾通络方高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠Tb.N和Tb.Th均明显升高（P<0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠第四腰椎骨密度及骨微结构比较（±s）

表2 各组大鼠第四腰椎骨密度及骨微结构比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量 BV/TV BS/BV(1/mm) Tb.N(1/mm) Tb.Th(mm) Tb.Sp(mm) BMD(mg/cm3)假手术组 8 - 0.512±0.122 15.820±2.717 4.649±0.319 0.151±0.030 0.111±0.025 0.641±0.028模型组 8 - 0.339±0.036a 20.399±2.299a 3.599±0.529a 0.094±0.009a 0.157±0.02a 0.589±0.023a补肾通络方高剂量组 8 14.40 g/kg 0.493±0.122b 16.618±3.329 4.224±0.289b 0.142±0.029b 0.117±0.032b 0.629±0.007b补肾通络方低剂量组 8 7.20 g/kg 0.459±0.097b 18.024±3.989 4.092±0.273 0.115±0.022 0.123±0.024b 0.626±0.026b戊酸雌二醇组 8 0.09 mg/kg 0.510±0.158b 16.510±3.761 4.303±0.413b 0.141±0.035b 0.116±0.035b 0.635±0.005b F 1.983 1.539 5.107 3.915 3.964 4.865 P 0.136 0.229 0.005 0.017 0.016 0.007

2.3 各组大鼠子宫内膜形态学变化 假手术组大鼠子宫内膜细胞排列整齐，腺体上皮呈高柱状，腺腔较大；模型组大鼠子宫内膜变薄，腺体稀少，部分呈囊性；戊酸雌二醇组大鼠子宫内膜增厚，少数腺体扭曲，腺上皮核大呈卵圆形，间质细胞较致密；补肾通络方高、低剂量组大鼠子宫内膜间质细胞梭形，较致密，腺上皮细胞呈低柱状，且随剂量增加，腺体数量明显增加。（见图1）

图1 各组大鼠子宫内膜形态学变化比较（HE，×100）

图3 各组大鼠子宫内膜β-catenin表达（免疫组化，×400）

2.4 各组大鼠子宫内膜ERα和β-catenin蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠子宫内膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表达水平均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾通络方高、低剂量组和戊酸雌二醇组大鼠子宫内膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表达水平均明显升高（P＜0.05）；补肾通络方高、低剂量组大鼠子宫内膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin表达水平与戊酸雌二醇组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表3、图2～3）

表3 各组大鼠子宫内膜ERα和β-catenin蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠子宫内膜ERα和β-catenin蛋白表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数(只)给药剂量 ERα β-catenin假手术组 8 - 0.092±0.015 0.089±0.01模型组 8 - 0.062±0.015a 0.062±0.012a补肾通络方高剂量组 8 14.40 g/kg 0.084±0.011b 0.084±0.011b补肾通络方低剂量组 8 7.20 g/kg 0.081±0.014b 0.079±0.017b戊酸雌二醇组 8 0.09 mg/kg 0.091±0.014b 0.086±0.015b F 6.042 5.166 P 0.000 0.002

图2 各组大鼠子宫内膜ERα表达（免疫组化，×400）

3 讨论

绝经后骨质疏松症属于中医学中“骨痹”“骨痿”“骨枯”等范畴[9-10]。《素问·痿论篇》曰：“肾主身之骨髓。”《素问·逆调论篇》曰：“肾者水也，而生于骨。肾不生则髓不能满，故寒甚至骨也。”肾精充足则骨髓生化有源，骨骼得以滋养而强劲有力；肾精亏虚则骨髓生化无源，骨骼失养而痿弱无力。妇女绝经后，肾气渐衰，天癸渐竭，骨髓化生无源，致髓枯骨脆、筋骨不坚；五脏虚损，气虚血瘀，新血生成受阻，骨髓化源不足，骨骼失养，骨质流失[11-12]。肾虚为本，血瘀为标，临床治疗在补肾益精同时兼顾益气活血。补肾通络方是我科治疗绝经后骨质疏松症的经验方，临床效果明显。方中淫羊藿、杜仲补肾助阳，共为君药；川牛膝活血化瘀、通利关节，鸡血藤、丹参活血通络，共为臣药；生地黄养阴生精，黄芪补气，共为佐药。诸药合用，共奏补肾通络、活血壮骨之功。

Micro-CT能够直观、立体地从空间结构上评价骨小梁微结构，指导临床用药和预防骨质疏松性骨折的发生。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠骨密度明显降低（P＜0.05），说明骨质疏松症模型制备成功。补肾通络方高、低剂量组大鼠骨密度明显高于模型组（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度均降低，骨小梁分离度升高，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与模型组比较，补肾通络方高、低剂量组和戊酸雌二醇组大鼠骨体积分数明显升高（P＜0.05），骨小梁分离度明显降低（P＜0.05）；补肾通络方高剂量组和戊酸雌二醇组骨小梁数量和骨小梁厚度均明显高于模型组（P＜0.05），骨微结构明显改善。

绝经后由于卵巢功能减退，E2含量明显降低，在生殖轴负反馈调节下，腺垂体分泌的FSH和LH浓度升高[13]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠血清E2含量降低、FSH和LH水平升高（P＜0.05），表明去势成功。补肾通络方高、低剂量组能升高去卵巢大鼠的血清E2含量，降低FSH和LH水平，与戊酸雌二醇组相比无明显差异。同时，HE染色显示，模型组大鼠子宫内膜变薄，腺体稀少。药物干预后，子宫内膜增厚，腺体稍增加，补肾通络方高、低剂量组和戊酸雌二醇组差异不明显。说明补肾通络方具有雌激素样作用。

雌激素的生物学效应是通过和雌激素受体（ER）结合来发挥的，其作用与ER的类型和数量有关[14]。雌激素受体有ERα和ERβ两种，其中ERα主要分布在子宫和乳腺[15]。ABBOTT M J等[16]研究发现ERα在女性绝经前、后子宫黏膜层、肌层、浆膜层所有细胞的细胞浆中均有表达，绝经后水平较绝经前降低。ERα和Wnt/β-catenin信号通路在大鼠BMSCs成骨分化过程中具有重要意义[17-18]。Wnt信号刺激后，β-catenin积聚并转入细胞核内，与转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子相结合，启动转录相关基因，使细胞活化增强，加强骨形成[19-20]。本研究免疫组化结果显示去势大鼠子宫内膜上皮及腺上皮ERα和β-catenin蛋白表达降低，经补肾通络方干预后，ERα和β-catenin表达均增强，与假手术组无明显差异。

综上所述，补肾通络方能改善去势骨质疏松症模型大鼠的骨量流失，具有雌激素样作用，可能是通过上调去势骨质疏松症模型大鼠子宫内膜ERα表达，激活Wnt/β-catenin信号通路而介导的。下一步研究还需要扩大样本量和体外实验来证实药物的有效性与安全性。