lncRNA CASC2靶向miR-217对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激的影响

周亚南 张建新 杜巍 胡大军 钟敏

心肌细胞损伤与多种心血管疾病的发生发展有关，其损伤与心肌细胞凋亡及氧化应激密切相关[1-2]，长链非编码RNA（lncRNA）可参与调控心肌细胞损伤[3-4]。LncRNA 癌易感性候选基因2（CASC2）通过调节微小RNA（miRNA）-144-3p/水通道蛋白1（AQP1）轴，减少肺上皮细胞凋亡，改善急性肺损伤[5]。在脂多糖刺激的人肾小管上皮HK-2 细胞中，CASC2 可以增加细胞活性，抑制炎性因子分泌、细胞凋亡和氧化应激，改善急性肾损伤[6]。CASC2 通过miR-133b/叉头框蛋白p1（FOXP1）轴调节人肾小球系膜细胞的增殖、细胞外基质积累和氧化应激[7]。上述研究提示CASC2具有抑制细胞凋亡和氧化应激、减轻细胞损伤的作用。研究表明，敲低miR-217 可减轻H9c2 细胞的心肌缺氧/复氧损伤[8]，改善氧葡萄糖剥夺和复氧诱导的神经元损伤[9]。过表达miR-217 可加重缺氧诱导的H9c2 细胞损伤[10]，而生物学预测软件显示miR-217 与CASC2 有靶向结合位点。本研究探讨CASC2 能否通过调控miR-217 影响心肌细胞凋亡和氧化应激。

1 材料与方法

1.1 材料

H9c2 细胞购自无锡欣润生物科技有限公司；DMEM 培养基购自上海高创化学科技有限公司；过氧化氢、四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海经科化学科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 细胞处理与分组

用DMEM 培养基培养H9c2 细胞，取对数生长期细胞并分组。模型（Model）组：用300 μmol/L过氧化氢处 理H9c2 细胞。Model＋pcDNA 组、Model＋pcDNA-CASC2 组：将空载体（pcDNA）、过表达CASC2 载体（pcDNA-CASC2）分别转染至H9c2 细胞后再用300 μmol/L 过氧化氢处理。Model＋anti-miR-NC 组、Model＋anti-miR-217组：将抑制物对照（anti-miR-NC）、miR-217 抑制物（anti-miR-217）分别转染至H9c2 细胞后再用300 μmol/L 过氧化氢处理。Model＋pcDNA-CASC2＋miR-NC 组、Model＋pcDNA-CASC2＋miR-217 组：将pcDNA-CASC2 分别与miR-NC、miR-217 共转染至H9c2 细胞后再用300 μmol/L 过氧化氢处理。对照组：正常培养的H9c2 细胞。各组细胞培养48 h。

1.3 qRT-PCR检测CASC2和miR-217的表达水平

提取各组细胞总RNA，参照逆转录试剂盒合成cDNA 模板，以cDNA 模板按荧光定量试剂盒说明进行PCR，相对表达水平用2-△△Ct法计算。CASC2 和miR-217 分别以GAPDH 和U6 为内参，CASC2 上游引物序列为5'-TACAGGAC AGTCAGTGGTGGTA-3'，下游引物序列为5'-AC ATCTAGCTTAGGAATGTGGC-3'；miR-217 上游引物序列为5'-CGCAGATACTGCATCAGG AA-3'，下游引物序列为5'-CTGAAGGCAATGCA TTAGGAACT-3'。

1.4 MTT检测细胞增殖

细胞培养48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液，孵育4 h 后加入二甲基亚砜（DMSO）反应10 min，用酶标仪检测490 nm 处检测吸光度（OD）值。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

细胞培养48 h，加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，避光孵育10 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平

提取细胞总蛋白，定量后取50 μL 蛋白样品进行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转至PVDF 膜，封闭后加入Bax、Bcl-2 一抗（稀释1 ∶800）4 ℃过夜，加入二抗室温培养1 h，加入化学发光试剂显影，以GAPDH 为内参分析蛋白条带灰度值。

1.7 试剂盒检测细胞SOD活性、MDA含量和培养液中LDH水平

细胞培养48 h 后收集各组细胞及细胞培养上清液，按试剂盒说明书检测细胞SOD 活性、MDA含量和培养液中LDH 水平。

1.8 双荧光素酶报告实验

构建CASC2 的野生型（WT-CASC2）和突变型（MUT-CASC2）荧光素酶载体，将其分别与miRNA 对照（miR-NC）和miR-217 共转染至心肌细胞中，按照说明书检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶报告基因活性值为参照，计算心肌细胞荧光素酶活性值。

1.9 统计学分析

用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CASC2对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的影响

与对照组相比，Model 组心肌细胞中CASC2 mRNA 表达水平和Bcl-2 蛋白表达水平降低，miR-217 和Bax 蛋白表达水平升高，心肌细胞活性、SOD 活性降低，凋亡率、MDA 含量和LDH 水平升高（P均＜0.05）；与Model组和Model＋pcDNA组相比，Model＋pcDNA-CASC2 组心肌细胞中CASC2 mRNA 表达水平和Bcl-2 的蛋白表达水平升高，miR-217 和Bax 蛋白表达水平降低，心肌细胞活性、SOD 活性升高，凋亡率、MDA 含量和LDH 水平降低（P均＜0.05）。见图1、表1、表2。

表2 CASC2对过氧化氢诱导心肌细胞OD值、凋亡率及氧化应激的影响（n＝3）

图1 CASC2对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的影响

表1 上调CASC2表达对心肌细胞CASC2、miR-217及凋亡相关蛋白表达的影响（n＝3）

2.2 CASC2靶向miR-217

CASC2 和miR-217 存在互补的核苷酸序列，见图2。miR-217 与WT-CASC2 共转染的心肌细胞荧光素酶活性降低，而miR-217 与MUT-CASC2共转染的心肌细胞荧光素酶活性无显著变化，见图2、表3。

表3 miR-NC或miR-217与WT-CASC2及MUT-CASC2共转染心肌细胞后双荧光素酶活性比较（n＝3）

图2 CASC2和miR-217的互补序列

2.3 抑制miR-217对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤氧化应激的影响

与Model 组和Model＋anti-miR-NC 组相比，Model＋anti-miR-217 组心肌细胞中miR-217、Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2 蛋白表达水平升高，心肌细胞活性升高，凋亡率降低，SOD 活性水平升高，MDA 含量和LDH 水平降低（P均＜0.05）。见图3、表4、表5。

表4 抑制miR-217对过氧化氢诱导的心肌细胞miR-217及凋亡相关蛋白表达的影响（n＝3）

表5 抑制miR-217对过氧化氢诱导的心肌细胞OD值、凋亡率及氧化应激的影响（n＝3）

图3 抑制miR-217对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的影响

2.4 miR-217可逆转CASC2对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的影响

与Model＋pcDNA-CASC2＋miR-NC 组相比，Model＋pcDNA-CASC2＋miR-217 组心肌细胞中miR-217、Bax 蛋白表达水平升高，Bcl-2 表达水平降低，心肌细胞活性降低，凋亡率升高，心肌细胞中SOD 活性水平降低，MDA 含量、LDH 水平升高（P均＜0.05），见图4、表6、表7。

表6 miR-217可逆转CASC2对过氧化氢诱导的心肌细胞miR-217和凋亡相关蛋白表达的影响（n＝3）

表7 miR-217可逆转CASC2对过氧化氢诱导的心肌细胞OD值、凋亡率及氧化应激的影响（n＝3）

图4 miR-217可逆转CASC2对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的影响

3 讨论

研究表明过氧化氢可进入细胞形成自由基，造成细胞损伤[11]。因此，本实验采用过氧化氢处理心肌细胞建立损伤模型，结果发现心肌细胞活性降低，凋亡率升高，SOD 活性降低，MDA 含量、LDH 水平升高。SOD、MDA、LDH 是氧化应激相关因子，其水平异常影响氧化应激的发生[12]，上述结果表明本研究成功建立心肌氧化损伤模型。

研究报道CASC2 通过调控miR-194-5p/陷窝蛋白-1（CAV1）轴减轻小鼠和细胞模型中高氧诱导的肺损伤[13]。CASC2 还可通过调节miR-9-5p/过氧化物酶体增殖物激活受体γ 轴提高细胞活性并抑制细胞凋亡，从而减轻高糖诱导的人足细胞损伤[14]。本研究中，过氧化氢诱导心肌细胞中CASC2 表达降低，过表达CASC2 后心肌细胞活性升高，凋亡率降低，SOD 活性升高，MDA 含量、LDH 水平降低，表明过表达CASC2 可抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激。

研究发现，慢性心力衰竭患者心脏中的miR-217 表达水平增加，miR-217 可促进心肌肥大和心功能障碍[15]。抑制miR-217 可降低柯萨奇病毒B3感染所致心肌炎中MDA 含量降低，SOD 活性增加[16]。下调miR-217 可抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP＋）诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡和氧化应激[17]。本研究显示，过氧化氢诱导的心肌细胞中miR-217 表达水平升高，抑制miR-217 表达可抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激。本研究还发现，CASC2 靶向调控miR-217，miR-217 可逆转CASC2 对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激的影响。

综上所述，过表达CASC2 通过靶向miR-217抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激。