硫化氢调节自噬改善糖尿病大鼠心肌纤维化

曾欧 肖归 陈海波 张意平

糖尿病心肌病（DCM）的发病机制与细胞自噬、凋亡及心肌纤维化等有关[1-2]。硫化氢（H2S）是具有多种生物学效应的气体信号分子[3]。研究发现，心脏纤维化及心脏重构与细胞自噬有关[4-7]。H2S 能改善糖尿病心肌纤维化，其改善作用是否与自噬相关，目前尚不清楚。本研究建立糖尿病大鼠模型，探讨气体信号分子H2S 是否通过调节细胞自噬改善糖尿病大鼠心肌细胞纤维化。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

成年清洁级雄性SD 大鼠60 只，体质量（280±40）g，订购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。动物饲养于清洁级实验室恒温（23±1）℃环境中，分笼饲养，人工照明，白天黑夜各12 h，所有大鼠均可自由获得水和食物。抗兔组织胶原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）、微管相关蛋白 1A/1B-轻链 3（LC3）、自噬蛋白P62、GAPDH 抗体购于美国Proteintech 公司；链脲佐菌素（STZ）购于阿拉丁公司；硫氢化钠（NaHS）购于美国Sigma 公司；抗兔二抗购于美国Proteintech 公司；BCA 蛋白定量试剂盒、细胞裂解液购于中国碧云天公司。

1.2 模型建立及分组

SD 大鼠饲养1 周后随机分为对照组、糖尿病组（STZ 组）、STZ＋高浓度H2S 组、STZ＋中浓度H2S 组、STZ＋低浓度H2S 组、STZ＋胱硫醚-γ-裂合酶（CSE）抑制剂炔丙基甘氨酸（PPG）组，每组10 只。大鼠按体质量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）40 mol/kg，注射72 h 后，尾静脉采血测血糖水平，血糖水平大于16.7 mmol/L 提示造模成功。造模成功后，STZ 组大鼠每天腹腔注射生理盐水（30 mg/kg）；STZ＋H2S 组大鼠每天腹腔注射NaHS 溶液（高、中、低浓度H2S 组NaHS分别为100 mg/kg、60 mg/kg、40 mg/kg)；PPG 组大鼠每天腹腔注射PPG 溶液30 mg/kg。对照组仅每天腹腔注射生理盐水30 mg/kg。大鼠在建模后至处死前陆续有死亡，且集中在建模后2 周内，各组死亡数量不等，共14 只大鼠死亡，至8 周末各组大鼠总生存率为76%（46/60）。

1.3 Masson染色观察大鼠心肌组织纤维化程度

取大鼠心尖组织，切片滴加核染液覆盖整个组织，染色完成后观察心肌组织病理纤维化程度。

1.4 Western blot法检测纤维化相关蛋白及自噬蛋白的表达

取各组大鼠左室心肌组织，提取蛋白并定量。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、转膜后，室温封闭2 h，抗Collagen Ⅰ、LC3、P62 抗体（1 ∶400 稀释）及抗GAPDH 抗体（1 ∶8 000 稀释）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵1 h。显影后行灰度扫描，以目的条带与GAPDH 条带的灰度比值计算蛋白相对表达水平，实验重复3 次。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌组织纤维化情况

对心肌组织进行Masson 染色，胶原纤维呈蓝色。对照组大鼠心肌细胞排列紧密整齐，心肌组织血管周围及肌间隙中仅有少量胶原纤维沉积；STZ组大鼠心肌细胞排列疏散紊乱，心肌组织胶原沉积较对照组增多，且向周围间质延伸，间质可见少量炎性细胞浸润；STZ＋H2S 组大鼠心肌组织胶原沉积较STZ 组明显减少，与STZ＋高浓度H2S 组相比，STZ＋低浓度H2S 组及STZ＋中浓度H2S 组鼠心肌组织胶原沉积明显增加，心肌细胞排列更加疏散紊乱。与STZ 组相比，STZ＋PPG 组大鼠心肌组织胶原沉积减少。与STZ＋高浓度H2S组相比，STZ＋PPG 组心肌组织胶原沉积明显增加，心肌细胞排列更加疏散紊乱。与STZ＋低浓度H2S 组及STZ＋中浓度H2S 组相比，STZ＋PPG 组心肌组织胶原沉积程度及心肌细胞排列疏散紊乱程度无明显差别。见图1。

图1 Masson染色示各组大鼠心肌组织纤维化情况（×400）

2.2 H2S对心肌组织中CollagenⅠ蛋白表达的影响

Western blot 法检测各组大鼠心肌组织CollagenⅠ蛋白表达水平。与对照组相比，STZ 组大鼠心肌组织中的CollagenⅠ蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与STZ 组相比，STZ＋H2S 组大鼠心肌CollagenⅠ蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）；与STZ＋高浓度H2S 组相比，STZ＋低浓度H2S 组及STZ＋中浓度H2S 组大鼠心肌组织中的CollagenⅠ蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与STZ 组相比，STZ＋PPG 组Collagen Ⅰ蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图2、表1。

图2 Western blot法检测各组心肌组织中Collagen Ⅰ蛋白表达情况

表1 各组心肌组织Collagen Ⅰ蛋白表达水平比较

2.3 H2S对心肌组织中LC3、P62蛋白表达的影响

Western blot 法检测各组大鼠心肌组织LC3、P62 蛋白表达水平。与对照组相比，STZ 组大鼠心肌组织中的P62 蛋白表达水平明显升高，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明显降低（P均＜0.01）；与STZ 组相比，STZ＋H2S 组大鼠心肌组织中的P62 蛋白表达水平明显降低，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明显升高（P均＜0.01），与STZ＋高浓度H2S 组相比，STZ＋低浓度H2S 组及STZ＋中浓度H2S 组大鼠心肌组织中的P62 蛋白表达水平明显升高，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明显降低（P均＜0.01）；与STZ 组相比，STZ＋PPG 组P62 的蛋白表达水平明显降低，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明显升高（P均＜0.01）。见图3、表2。

图3 Western blot法检测各组心肌组织中LC3、P62蛋白表达情况

表2 各组心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及P62蛋白表达水平比较

3 讨论

糖尿病心肌病是指发生于糖尿病患者，不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其他心脏病变来解释的心肌疾病。糖尿病心肌病会导致心室功能障碍[8-10]。

糖尿病心肌病主要表现为心肌细胞肥大、心肌纤维化和心脏微小血管病变，可引起心肌肥大和充血性心力衰竭[11]。心肌纤维化的特征是细胞外基质过多，胶原蛋白增多[12-13]。研究发现，糖尿病的心肌损害与内质网应激和自噬调节失衡等有关[14]。自噬广泛存在于真核细胞中，在细胞存活的调节中起着重要作用[15-16]。诱导细胞自噬，可延缓小鼠特发性肺纤维化进展[17]。自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变为膜型（即LC3-Ⅱ），因此，LC3-Ⅱ/LC Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低。P62 是已知的自噬蛋白，也称为SQSTM1 蛋白，在细胞内P62 表达水平与自噬活性呈负相关。P62 蛋白是自噬激活的标记物，LC3 Ⅱ增加，说明自噬小体增加，如果P62 同时减少，说明自噬活性增强，如果P62 同时增加，说明自噬小体降解过程被抑制，即自噬过程下游被抑制[18-19]。

本研究通过Masson 染色，发现糖尿病大鼠心肌中CollagenⅠ明显增加，经过H2S 及CSE 抑制剂干预后的糖尿病大鼠，心肌组织中CollagenⅠ明显减少，由此推测气体信号分子H2S 可改善糖尿病大鼠心肌纤维化，在不同浓度H2S 的实验中发现，较高浓度的H2S 改善糖尿病大鼠心肌纤维化更明显。在糖尿病大鼠中，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低，P62 表达水平升高，提示糖尿病大鼠的自噬过程被抑制。本研究发现，H2S 干预后糖尿病大鼠心肌组织LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高，P62 表达水平降低，提示自噬过程被激活；采用CSE 抑制剂对糖尿病大鼠进行干预后，大鼠心肌中CollagenⅠ明显减少，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高，P62 表达水平降低，自噬过程被激活。在不同浓度研究中发现，较高浓度的H2S 干预后，自噬过程的激活更为明显。

综上所述，H2S 通过激活自噬，改善因糖尿病导致的心肌纤维化，但是其具体调节机制及相关通路有待进一步研究。