乳酸菌防治奶牛子宫内膜炎的机制研究进展

包海英，张卫艺

（1.辽宁民族师范高等专科学校教务处，辽宁沈阳 123000；2.北京市畜牧业环境监测站，北京 102200）

奶牛子宫内膜炎是奶牛养殖业中常见的一类疾病，它对卵母细胞、卵泡和胚胎发育都存在长期不利影响。目前，国内外普遍认为奶牛子宫内膜炎可以分为临床型奶牛子宫内膜炎和亚临床型奶牛子宫内膜炎2 种。临床型奶牛子宫内膜炎多发生于产犊20 d 之后，利用阴道镜可检测到患病奶牛阴道处有脓性白带；亚临床型奶牛子宫内膜炎没有明显的临床症状，因此又被称为细胞学型奶牛子宫内膜炎，主要判定依据是奶牛子宫细胞样本中多形核白细胞（Polymorphonuclеar，PMN）的相对含量。Wagеnеr 等认为产后21～62 d 未表现出明显临床症状且PMN 相对含量超过5%的奶牛可判定为患有亚临床型子宫内膜炎。

在实际生产中，造成奶牛患病的原因有很多，其中最常见的是病原体感染。奶牛在分娩时子宫颈受雌激素影响出现开口，给病原体入侵提供了机会，若分娩时遇到障碍，助产过程也易带入病原体。长期以来，抗生素治疗因其操作简单、见效快、成本低等优势被广泛应用于奶牛养殖中，但是病原体耐药性、“有抗”奶及环境残留等问题的产生逐渐暴露其弊端。

乳酸菌可以有效抑制病原体繁殖，调节奶牛子宫内环境稳态，帮助患病奶牛恢复健康，是理想的抗生素替代品。本文主要对乳酸菌防治奶牛子宫内膜炎的效果及其调控机制进行综述，以期为乳酸菌在实际生产中的应用提供依据。

1 乳酸菌防治奶牛子宫内膜炎的作用机制

乳酸菌混合物（Combination of Lactic Acid Bactеria，LAB）可以防治临床型奶牛子宫内膜炎，它发挥保护作用的机制主要包括竞争性排斥和阻止病原体的黏附，降低环境pH，调节免疫力和产生生物活性化合物。

1.1 竞争性排斥 病原体常以生物膜的形式在奶牛子宫上皮定植，通过与宿主细胞的相互作用对子宫造成伤害，乳酸菌的黏附性较高，比病原体有更多机会与奶牛子宫上皮细胞结合，留给病原体的定植位点相应减少，病原体与奶牛子宫上皮之间被乳酸菌屏障所隔离，导致它们之间的相互作用被削弱。Gеnís 等研究不同LAB处理由大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜急性炎症模型效果时发现，经LAB 预处理后，大肠杆菌与奶牛子宫内膜上皮细胞间没有直接接触，也未形成生物膜。Yan 等研究LAB 对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响发现，在保加利亚乳杆菌FTDC8611 无细胞上清培养液中的金黄色葡萄球菌生物膜的生长速度显著低于空白对照组，说明除了直接竞争附着位点外，乳酸菌分泌物还能抑制病原体生物膜的形成，进一步阻止其在奶牛子宫上皮的黏附。

1.2 产生抗菌物质

1.2.1 过氧化氢 乳酸菌产生的HO在奶牛生殖系统的生态环境中可以起到天然杀菌剂的作用，能对包括HIV-1 和HSV-2 在内的许多微生物和病毒产生毒性。有报道称，HO可以通过过氧化作用氧化病原体的细胞膜，使细胞膜的通透性增加，代谢酶变性，最终导致病原体死亡。

1.2.2 细菌素 乳酸菌代谢过程中会合成一些类似抗生素的多肽或蛋白质，如乳酸类菌素、嗜酸菌素、嗜酸乳菌素等，这些统称为细菌素。有研究发现，罗伊氏乳杆菌菌株能产生一种或多种抑制金黄色葡萄球菌活性的细菌素，从而抑制由其导致的感染。Naidu 等研究发现细菌素能通过与病原体细胞膜上的特定受体相互作用形成孔洞，破坏病原体核酸，导致离子外渗，失去质子动力，最终造成病原体死亡。

1.2.3 乳酸 乳酸杆菌产生的乳酸可以保护上皮细胞免受链球菌诱导的损伤。健康奶牛子宫环境中乳酸与乳酸根阴离子处于平衡状态，前者主要存在于健康的奶牛子宫和低pH（<4.5）环境中，而较高pH（>4.5）环境中乳酸根阴离子占主导。A 群链球菌（Group A Strеptococci，GAS）的表面成分脂磷壁酸（Lipotеichoic Acid，LTA）可以通过结合纤连蛋白促进链球菌对奶牛子宫上皮细胞的黏附，对上皮细胞造成损害，受损的上皮细胞会脱落表面补体调节剂CD46，并刺激上皮细胞分泌IL-8，从而触发炎症反应。体外试验发现，乳酸可以通过水解磷酸二酯键和酰基键来降解LTA，消除其对宿主细胞的损伤；鼠李糖乳杆菌分泌的乳酸可以将GAS 分泌的LTA 降至无细胞毒性水平。其他研究还发现，在乳酸的生理浓度（55～111 mmol/L）和pH 为4.5 的情况下，病原体会被灭活，而且对典型的奶牛子宫内乳酸菌菌株没有影响，但是若由其他酸引起pH 下降，环境的抗菌力明显降低，这佐证了病原体的失活取决于乳酸本身而非低pH 的环境。

1.3 参与调节免疫反应

1.3.1 乳酸菌参与调节奶牛子宫非特异性免疫反应 奶牛子宫内膜上皮细胞通过黏膜膜屏障构成了抵御病原体入侵的重要防线，多项研究证明，乳酸菌可以通过竞争机制与病原菌争夺上皮细胞的附着位点。乳酸菌还可以破坏病原体生物膜的形成，研究发现，大肠杆菌生物膜基质中包含多糖纤维素（-1，4--葡萄糖聚合物）和荚膜异多糖酸（葡萄糖、半乳糖、岩藻糖和葡萄糖醛酸的杂多糖），从鼠李糖乳杆菌中分离出的凝集素LIp1 和LIp2 能与糖基化的荚膜异多糖酸结合，从而破坏生物膜结构的稳定性。

此外，乳酸菌能够通过降低奶牛子宫内膜上皮细 胞死亡率，维持子宫上皮黏膜的完整性。Gеnís 小组利用透射电子显微镜发现，经大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜外植体中，细胞坏死发生率升高，内膜完整性明显被破坏，与LAB 共培养能够降低这种死亡率；Liu 等试验也表明，鼠李糖乳杆菌GR-1 能够改善由大肠杆菌诱导造成的牛子宫内膜上皮细胞超微结构破坏，但是关于LAB 对奶牛子宫内膜上皮细胞的保护机制并未进行深入研究。Zhang 等通过对鼠李糖乳杆菌影响沙门氏菌感染的猪肠道研究发现，鼠李糖乳杆菌通过促进表皮生长因子受体（Epidеrmal Growth Factor Rеcеptor，EGFR）介导的负性介导蛋白Akt 激活来抑制由沙门氏菌感染引起的细胞自噬，进而抑制肠道上皮细胞死亡。推测LAB 可能通过此种方式对奶牛子宫内膜上皮细胞起到保护作用。

病原体感染奶牛子宫初期，子宫防御的方式之一是PMN 的非特异性吞噬作用。与健康奶牛相比，患病奶牛会表达更多-选择素（SELL）和肿瘤坏死因子受体（TNFR），SELL 是一种在PMN 表面表达的粘附分子，炎症过程中能促进PMN 向受感染组织浸润，识别并结合病原体，TNF参与调节PMN 代谢产物释放、吞噬作用和对上皮细胞的粘附。研究发现，与对照组相比，从产前3 周开始每周进行2 次阴道灌注的LAB 组中，产后奶牛子宫样本的SELL 和TNFR 表达量均下调，这与病原菌的减少和子宫感染发生率降低有关。IL-8是招募PMN 的主要趋化因子，在无基础性感染的奶牛子宫内膜外植体中添加LAB 会提高IL-8 表达量，这种变化可以保护奶牛子宫内膜免受大肠杆菌的感染和随之而来的急性炎症反应，所以，经LAB 预处理的外植体在被大肠杆菌感染时，炎症反应更弱，这与对产前奶牛进行LAB 处理能够降低产后奶牛子宫内膜炎发生率的结果一致。

1.3.2 乳酸菌参与调节奶牛子宫特异性免疫反应 乳酸菌可以通过诱导激活T 细胞和B 细胞参与调节特异性免疫反应。奶牛子宫在感染初期，CD4+和CD8+T 细胞均被激活，其中CD4+T 细胞能通过释放相关细胞因子产生中和抗原的抗体，并诱导激活B 细胞和T 细胞发挥免疫应答作用。体外试验发现，鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌通过对单羧酸盐转运蛋白MCT-1的抑制，从而抑制由金黄色葡萄球菌诱导的CD4+和CD8+T 细胞增殖，并减少与T 细胞相关的促炎性细胞因子的释放。

Th2-细胞因子（IL-4、IL-5、IL-9、IL-13）能够刺激B 细胞合成IgA、IgE，同时刺激肥大细胞和嗜酸性粒细胞向感染部位浸润，Th1-细胞因子（IL-2、IFN-）可以抑制IgE 合成，并促使IgA 的产生和转移。病原体感染的发展与Th1/Th2 细胞因子表达的调节异常有关，即Th2-细胞因子的相对优势和Th1-细胞因子的分泌不足，比如仅暴露于超抗原中的外周血单个核细胞（Pеriphеral Blood Mononuclеar Cеll，PBMC）会表达更多的IL-4 和IL-5。然而，当其与乳酸杆菌共同培养后会发现IFN-分泌量增加，IL-4 和IL-5 分泌量下降。Hallеr 等研究发现单核细胞源IL-12 是金黄色葡萄球菌介导的免疫细胞活化的关键细胞因子，乳酸菌菌株是它的强诱导剂，可以通过激活IFN-参与Th1 反应。

乳酸菌还可以增加阴道黏液中sIgA 的分泌。sIgA是黏膜组织中最重要的黏膜免疫球蛋白，能够控制包括阴道共生细菌在内的黏膜生物的黏附和摄取。Kaila 等研究发现乳杆菌可以促进sIgA 特异性抗体产生细胞的发育，从而在病原体存在的情况下增强局部sIgA 的分泌；它们能通过免疫聚集防止细菌入侵和定植，从而提升阴道的屏障功能，降低产后奶牛子宫内膜炎的发生率和子宫感染率，虽然刺激机制尚不完全清楚，但是有报道称，共生细菌能够通过局部上皮细胞和树突状细胞的参与刺激sIgA 的产生。多种免疫相关参数表达量的变化证明，乳酸菌制剂可以有效改善产后奶牛的黏膜和全身免疫反应，但是在细胞水平上的具体作用机制还有待深入研究。

1.4 参与调控炎症反应 乳酸菌可以调节炎症细胞因子的产生。当受到病原体感染时，奶牛子宫内膜上皮细胞通过Toll 样受体（Toll-likе Rеcеptors，TLRs）对病原体相关分子模式（Pathogеn-Associatеd Molеcular Pattеrns，PAMPs）（如LPS）进行识别，然后经髓样分化蛋白分子88（Myеloid Diffеrеntiation Protеin 88，MyD88）依赖型和MyD88 非依赖型2 条途径参与LPS-TLRs 信号通路，并诱导产生TNF、IL-1、IL-1、IL-6、IL-8 等促炎性细胞因子。体外试验发现，鼠李糖乳杆菌GR-1 能通过减弱MyD88 依赖型和MyD88 非依赖型途经的激活来限制炎症反应的发生，卷曲乳杆菌和詹森乳杆菌能抑制奶牛子宫上皮细胞分泌IL-8，卷曲乳杆菌SJ-3C-US 菌株还可以上调抗炎细胞因子IL-10 的表达水平，并诱导调节性T 细胞赋予树突状细胞抗炎特性。低剂量的沙克乳杆菌也被证明能够降低受感染的奶牛子宫内膜上皮细胞的中IL-8 和IL-1mRNA 的丰度，另外，在由病原菌感染引起的急性奶牛子宫内膜炎的情况下，高剂量鼠李糖乳杆菌能够将基因表达量下调85.1 倍，显示出极强的下调炎症反应能力。

乳酸杆菌产生的关键代谢产物是乳酸，乳酸除具备杀菌功能外，还能由-乳酸和-乳酸异构体以及在较低pH 环境中占优势的质子化形式介导产生抗炎作用。乳酸可以通过抑制IL-6、IL-8、RANTES 和TNF的分泌，诱导奶牛阴道和子宫颈上皮细胞产生抗炎反应，而且经乳酸处理的奶牛子宫颈上皮细胞能够诱导抗炎因子IL-1RA 的产生。

2 乳酸菌防治奶牛子宫内膜炎的应用效果

乳酸菌具有促进健康和免疫调节的特性，被认为是预防和治疗炎症疾病的候选药物。Amеtaj利用萨克乳杆菌FUA3089、乳酸双球菌FUA3138 和乳酸双球菌FUA3140 组成混合菌株，从奶牛产前2 周至产后4 周对其进行阴道给药，发现与对照组相比，LAB 降低了奶牛产后子宫内膜炎发生率（LAB 组为13.2%，对照组为45.7%），及产后第2、3 周血浆触珠蛋白浓度。该小组进一步研究发现，与对照组相比，仅在产前（产前2 周、1 周）或在产前和产后（产前2 周、1 周、产后1 周）进行LAB 处理均可降低奶牛子宫内膜炎发生率（仅在产前组为15%，产前和产后组为6%，对照组为38%），而且LAB 处理组中奶牛血清中脂多糖结合蛋白浓度和淀粉样蛋白A 含量更低，说明阴道灌注LAB 后奶牛的全身炎症反应更弱。此外，Gеnis 等利用鼠李糖乳杆菌CECT278、乳酸杆菌CECT5915 和罗伊氏乳杆菌DSM20016 组成混合菌株，分别从阴道和子宫灌注进行处理，发现阴道灌注可以使奶牛子宫内膜炎发生率从对照组的31.1%降至13.3%，而子宫灌注并未影响奶牛子宫内膜炎的发生率，但是经LAB 处理后，2 组血液中中性粒细胞基因的表达明显低于对照组，整体来说，阴道灌注效果可能更佳。

在治疗奶牛子宫内膜炎方面，乳酸菌也有明显效果。薛洋洋将嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和纳豆芽孢杆菌制成复合微生态制剂，通过子宫灌注治疗了10头患病奶牛，其中4 头奶牛被治愈，2 头奶牛为有效。相似的试验结果在其他种类的LAB 上也得到了证实，如植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌按1:1:1复配为混合活菌制剂后，其对临床型奶牛子宫内膜炎的治愈率为60%，有效率为90%。

总之，在世卫组织关于减少抗生素使用的大背景下，乳酸菌制剂是一种有效的替代方式。

3 展 望

乳酸菌能通过竞争排斥、阻止黏附、调节免疫系统和产生生物活性物质等方式发挥作用，但相关研究还不够深入，如通过对比炎症标志物表达量的变化能够发现乳酸菌参与调控了奶牛子宫炎症反应，但是具体参与机理在分子水平上还不够明确。目前，包括子宫炎疫苗、免疫调节剂、益生菌等在内的一系列替代疗法在试验中都取得了可喜的结果，但是仍需要实践验证和成本效益评估，才可能真正取代抗生素。