猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的建立

袁 梦，常 巍，杨世丽，周海欧，李翠婷，马燕梅

（福建农林大学 动物科学学院（蜂学学院），福建 福州 350002）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）严重威胁着猪养殖业，其病原体伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种囊膜病毒，其遗传物质是线性双链DNA分子，编码至少70种蛋白质［1－2］，可感染多种动物。研究表明PRV在小鼠体内可引起细胞因子风暴以及细胞炎症性坏死［3］。猪是PRV的唯一储存宿主，母猪感染PRV后易出现不孕、流产，仔猪感染PRV后会出现腹泻、呼吸衰竭甚至死亡［4］。成年猪感染PRV康复后经常形成潜伏感染，带毒的猪不发病，但在一定条件下会释放病毒，成为猪群中的主要传染源［5］。有研究表明，PRV在中国猪群中依然存在持续传播，并且存在跨物种传播现象［6］。有报道指出PRV可以感染人，导致人眼内炎和急性脑炎，并在患者脑脊液中分离出了PRV毒株hSD-1/2019［7］。因此如何准确、便捷地检测PRV已成为亟待解决的问题。gE蛋白包含577个氨基酸［8］，是由us8基因编码形成异二聚体的囊膜糖蛋白［9］；gE是PRV主要的囊膜毒力蛋白［10］，编码囊膜蛋白gE的基因变异程度低，该蛋白能介导PRV与宿主动物细胞的融合，促进PRV的扩散与释放，导致PRV对宿主体内嗜神经组织的趋向性，有利于PRV在高级神经中枢神经突触间传递扩散［11－12］。用缺失gE基因的PRV毒株感染动物，病毒在动物鼻腔上皮细胞中的复制不受影响，但其在神经组织中产生的伤害显著下降［13］。目前生产上常见的PRV基因缺失株疫苗多缺失gE基因，因此检测gE可以区分野毒株和疫苗株［9］。重组PRV gE可用作血清诊断试验，检测其特异性抗体并区分是否为疫苗接种动物［14］，因此制定针对PRV gE抗体的检测方法具有十分重要的意义。

本试验先对gE蛋白进行原核表达并纯化，在免疫BALB/c小鼠后制备gE单克隆抗体，建立竞争ELISA抗体检测方法，制备抗体检测试剂盒，为获得一种更廉价有效的检测方法寻找新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PRV FA株和SP2/0细胞由本实验室保存；DH5α和BL21（DE3）感受态细胞购自福州晴百旺生物科技有限公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Viral DNA/RNA Kit、完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂购自全式金生物技术有限公司；无内毒素质粒中提试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司；DNA纯化试剂盒购自威格拉斯生物技术有限公司。

1.2 质粒构建以及动物免疫

1.2.1gE基因的扩增及质粒构建 从NCBI上下载PRV FA株的全基因序列（KM189913），用Snapgene软件根据PRV gE基因主要抗原表位区段（561 bp）设计1对引物：gE-F 5′-CGGGATCCGAGGCC GACGACG-ATGACCTCAA-3′（BamH I）；gE-R 5′-CGGAATTCCGAGAAGAGCTGCGAGTGGAA -3′（EcoR I）。提取PRV-FA株的DNA为模板，以94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min的条件进行PCR扩增，对产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在核酸凝胶成像仪的紫外灯下将目的片段切下。

1.2.2 pET-28a-gE表达质粒的构建 将目的片段与载体分别用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切，载体酶切体系：载体pET-28a 2 μL、BamH I 1 μL、EcoR I 1 μL、10×Buffer 4 μL、ddH2O 32 μL。目的片段酶切体系：目的片段30 μL、BamH I 1 μL、EcoR I 1 μL、10×Buffer 4 μL、ddH2O 4 μL。将经金属浴（37 ℃ 1 h）双酶切后的载体与目的片段用DNA纯化试剂盒纯化，然后用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系：目的片段 8 μL、载体DNA 2 μL、T4 DNA连 接 酶1 μL、10×Buffer 1.5 μL、ddH2O 2.5 μL。将连接体系在金属浴（16 ℃）中连接过夜。用连接产物转化DH5α感受态细胞，涂具有卡那抗性的LB固体培养基平板，第2天挑取菌落至具有卡那抗性的LB液体培养基中，在摇床（37 ℃、200 r/min）上培养12 h，再用无内毒素质粒中提试剂盒提取质粒，进行双酶切鉴定。将鉴定正确的质粒送北京擎科生物技术有限公司进行测序。

1.2.3 重组蛋白gE-6×His的诱导表达和可溶性鉴定 将测序正确的质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，涂具有卡那抗性的LB固体培养基平板，第2天挑取菌落至具有卡那抗性的LB液体培养基中，在37 ℃、200 r/min的摇床上培养4 h；用1.2节中的方法，将菌液作为模板，进行菌液PCR鉴定，将阳性菌按菌液∶培养基=1∶100的体积比加入具有卡那抗性的LB液体培养基中，置于37 ℃、200 r/min的摇床上培养1～2 h；当菌液的OD600值约为0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，在25 ℃、200 r/min的摇床上培养6 h，然后在4 ℃下以8000 r/min的转速离心5 min，收集菌体沉淀，进行超声波破碎，将破碎后的菌体沉淀进行SDS-PAGE电泳，电泳凝胶用考马斯亮蓝染色液染色后用清水脱色，观察目的蛋白条带。

1.2.4 重组蛋白gE-6×His的纯化 使用结合缓冲液平衡镍柱，将蛋白样本通过恒流泵流入镍柱；再用结合缓冲液洗涤镍柱，依次用100、200、300、400和500 mmol/L咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集从镍柱底端流出的各浓度的洗脱缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，电泳凝胶用考马斯亮蓝染色液染色后用清水脱色，观察蛋白的纯化情况。

1.2.5 小鼠免疫 将纯化后的蛋白与佐剂按体积比1∶1乳化，然后免疫BALB/c小鼠，采用背部皮下多点注射的方法进行免疫，每只小鼠每次免疫注射100 ng重组蛋白gE-6×His，免疫间隔14 d。首次免疫采用完全弗氏佐剂，二免和三免均采用不完全弗氏佐剂，三免后对小鼠进行尾部采血，检测小鼠血清抗体效价。选择血清效价最高的小鼠，在三免后第14天不用任何佐剂，将100 ng纯化后的融合蛋白注射小鼠腹腔，进行加强免疫。

1.3 竞争抑制ELISA检测方法的建立

1.3.1 最佳反应条件的确定 用方阵滴定法确定抗原浓度及免疫鼠血清稀释度，将融合蛋白进行倍比稀释，包被96孔酶标板，将纯化后的蛋白用包被缓冲液倍比稀释到浓度分别为2500、1250、625、312.5、156.25、78.15、39.06、19.53、9.77、4.88和2.44 ng/mL，按100 μL/孔加入酶标板。一抗使用的免疫鼠血清的倍比稀释度为从1∶1000到1∶64000，每个蛋白包被的浓度设1个PBS阴性对照。二抗使用PBS配制的3%脱脂牛奶的羊抗鼠HRP，稀释度为1∶2000。显色后加终止液，测定OD450值，OD450值≈1的孔对应的抗原包被浓度和一抗稀释度为最佳条件。

1.3.2 血清的最佳稀释度 根据优化后的竞争ELISA条件，分别取阳性和阴性待检血清，按1∶2、1∶4、1∶8和1∶16进行倍比稀释，用1.3.1节中的方法进行检测，计算血清抑制率（%），确定待检血清的最佳稀释度。

1.3.3 阴阳性判断标准的确定 对24份PRV阴性血清用已建立的竞争ELISA方法进行检测，计算血清抑制率，并按公式“阴阳性临界值=X+3×SD”计算阴阳性临界值，其中X是检测的阴性血清抑制率的平均值，SD是其标准方差。

1.3.4 临床检测 使用建立的ELISA方法检测32份待测猪血清，同时运用PCR方法进行检测，并比较两者的检测结果。

1.4 单克隆抗体的制备

1.4.1 细胞融合 在小鼠加强免疫后第3天进行细胞融合，于细胞融合前1 d取非免疫BALB/c小鼠腹腔的巨噬细胞，铺96孔细胞培养板，制备饲养层细胞。在细胞融合前将小鼠脱颈处死，于75%乙醇中浸泡5 min，在超净台中无菌取小鼠脾脏，在200目细胞筛上将脾脏研碎，用在4 ℃下储存的无血清1640培养基冲洗细胞筛，将收集的滤液以2000 r/min离心10 min，弃上清液，加10 mL 1640培养基，并进行细胞计数。选状态良好的SP2/0细胞，按SP2/0细胞∶脾细胞=1∶5的比例混匀，以2000 r/min离心10 min；弃上清液，在1 min内加入40 ℃水浴的50% PEG 4000溶液，滴加同时混匀；在90 s内加入37 ℃水浴的无血清1640培养基，加至50 mL时终止融合，将混合细胞以2000 r/min离心10 min；弃上清，用37 ℃水浴的20% FBS HAT 1640选择培养基稀释细胞至每毫升2×106个脾细胞，加入96孔板（已有饲养层细胞），每孔加入100 μL，于37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.4.2 杂交瘤细胞的筛选 于细胞融合后第4天，用20% FBS HAT 1640选择培养基半量换液；在细胞融合后第8、9和12天，用20% FBS HT 1640选择培养基半量换液。从第12天到第16天，用1.3.1节中建立的间接ELISA方法检测上清抗体，阴性、阳性对照分别为SP2/0上清和免疫鼠血清。用间接ELISA方法检测上清抗体应重复2～3次，对稳定分泌抗体的孔进行亚克隆。用有限稀释法将阳性细胞进行连续2～3次的亚克隆，用间接ELISA方法检测上清抗体，当用于筛选的孔中的上清液阳性率达到100%时，即表明筛选到可以稳定产生单一抗体的杂交瘤细胞。

1.4.3 小鼠单抗腹水诱导 提前1 d向10周龄BALB/c小鼠腹腔注射不完全弗氏佐剂0.5 mL。第2天将处于对数生长期且生长状态良好的杂交瘤细胞吹下，以800 r/min离心5 min，用PBS洗涤3次，进行细胞计数；加适量PBS，调整细胞密度至每毫升2×106个杂交瘤细胞；向小鼠腹腔注射该液0.5 mL，在注射后7～10 d小鼠腹腔膨大，用注射器收集腹水，以8000 r/min离心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃。

1.5 单克隆抗体的鉴定

1.5.1 单克隆抗体效价的测定 将腹水上清从1∶1000开始稀释，测定OD450nm值。选择OD450nm值≥0.2、P/N值≥2.1且最高稀释倍数为最佳稀释度效价。

1.5.2 单克隆抗体的Western-blotting鉴定 提取攻毒PRV的PK15细胞蛋白样本，将未攻毒的细胞样作为阴性对照，使用Western-blotting鉴定免疫原性。

1.5.3 单克隆抗体的特异性检测 使用间接ELISA方法检测单克隆抗体的特异性，以PRV、PRRSV、VSV包被酶标板，杂交瘤细胞上清为一抗，羊抗鼠HRP为二抗检测抗体的特异性。

1.6 数据处理与分析

使用SPSS软件对试验数据进行t检验、成对双样本均值分析，与对照组相比，**、****、NS分别表示P＜0.01、P＜0.0001、不显著。

2 结果与分析

2.1 质粒构建及蛋白纯化

2.1.1gE基因的扩增及pET-28a-gE表达质粒的构建 以PRV PK-15培养物为模板，用设计的特异性引物进行扩增，并通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。在图1A中，扩增片段PRV gE主要抗原表位区段约为573 bp，符合预期；用内切酶BamH I和EcoR I酶切重组质粒，证明pET-28a-gE构建完成。图1B是pET-28a-gE的酶切结果，得到预期大小的条带（目的片段大小约为573 bp）。质粒送擎科公司测序，结果正确。

图1 gE基因的扩增及pET-28a-gE表达质粒的构建

2.1.2 重组蛋白gE-6×His的诱导表达和可溶性鉴定 pET-28a-gE表达融合蛋白gE-6×His是在25 ℃、0.5 mmol/L IPTG、150 r/min的条件下诱导6 h后获得的。与pET-28a-gE诱导前的表达产物比较，pET-28a-gE诱导后出现了1条25～35 kDa的条带，大小约为25.7 kDa（图2A），符合预期，说明融合蛋白gE-6×His诱导表达成功。从图2B可以明显看出融合蛋白gE-6×His在上清中。

图2 重组蛋白gE-6×His的诱导表达和可溶性鉴定结果

2.1.3 重组蛋白gE-6×His的纯化 融合蛋白诱导后超声破碎，进行gE-6×His和gH-6×His镍亲和层析，图3是可溶性融合蛋白gE-6×His的纯化结果，可见纯化后条带单一，可用作抗原进行免疫。

图3 融合蛋白gE-6×His的纯化结果

2.2 竞争抑制ELISA检测方法的建立

2.2.1 棋盘滴定法确定最佳反应条件 通过方阵滴定试验，以PRV做抗原包被，以gE单克隆抗体做检测抗体，结果显示，当PRV包被的稀释度为1.25 μL/mL、单克隆抗体的稀释度为1∶400时，OD450值为0.95（表1）。

表1 竞争ELISA检测方法的优化结果（OD450值）

2.2.2 待检血清最佳稀释度的确定 通过方阵滴定试验，以PRV做抗原包被，以gE单克隆抗体做检测抗体，试验结果如表2所示，当血清的稀释度为1∶2时，阳性、阴性的抑制率均最高，分别为49%和5%。

表2 血清最佳稀释度的确定结果（抑制率） %

2.2.3 阴阳性判断标准的确定 用以上建立的竞争ELISA方法检测24份gE多抗阴性血清，其抑制率平均值（X）为9.98，标准方差（SD）为2.83，根据公式：阴阳性临界值=X+3×SD，得出gE多抗血清的阴阳性临界值为18.47。

2.2.4 临床检测 用gE单克隆抗体建立的竞争ELISA抗体检测方法检测32份血清，检出7份阳性、25份阴性（表3），与PCR检测结果（图4）相符。

表3 临床检测结果

图4 32份血清的PCR检测结果

2.3 单克隆抗体的制备

2.3.1 间接ELISA检测鼠血清抗体方法的优化 用方阵滴定法确定抗原包被的浓度和抗体的稀释度。当融合蛋白gE-6×His包被的浓度为0.63 μg/mL、阳性血清的稀释度为1∶128000时，OD450值为1.01（表4）。

表4 间接ELISA检测鼠gE抗体方法的优化结果（OD450值）

2.3.2 间接ELISA检测杂交瘤细胞株 通过间接ELISA方法检测杂交瘤细胞株上清的抗体效价，得到了7株细胞，将其分别命名为1C1、1B2、1D5、3D6、3G6、3E7、3C10。

2.3.3 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 细胞融合后的阳性孔中通常有不止1种杂交瘤细胞，为了得到单克隆杂交瘤细胞，用有限稀释法筛选单个杂交瘤细胞，结果得到2株能够稳定产生抗体的杂交瘤细胞1B2和3E7（图5）。

图5 杂交瘤细胞的形态

2.4 单克隆抗体的鉴定

2.4.1 单克隆抗体效价的测定 取过度培养的杂交瘤细胞上清和小鼠腹水，从1∶10开始稀释，用间接ELISA方法检测效价，结果细胞上清的抗体效价为1∶2560，小鼠腹水的抗体效价为1∶5120（表5）。

表5 单克隆细胞培养基抗体效价的检测结果（OD450值）

2.4.2 杂交瘤细胞稳定性的鉴定 杂交瘤细胞冻存可能会影响其产生抗体的能力，为了确定其能否稳定产生抗体，用间接ELISA方法对复苏后的细胞培养上清进行检测。结果发现冻存前和复苏后产生抗体的能力变化小，单克隆细胞3E7的抗体分泌能力更稳定（图6）。

图6 杂交瘤细胞稳定性的检测结果

2.4.3 单克隆抗体的特异性检测 用间接ELISA方法检测单克隆抗体的特异性，以PRV、PRRSV、VSV包被酶标板，以杂交瘤细胞上清为一抗，结果表明，单克隆抗体具有特异性（图7）。

图7 间接ELISA方法检测单克隆抗体的特异性

2.4.4 单克隆抗体的Western-blotting鉴定 将PK15细胞作为阴性对照，用Western-blotting鉴定单克隆抗体的特异性，结果显示PK15 PRV-FA培养物出现了1条大小约120 kDa的单一条带，而阴性对照没有条带，说明单克隆抗体能特异性地与PRV结合，特异性高（图8）。

图8 单克隆抗体的Western-blotting鉴定结果

3 讨论

生猪集约化养殖现今已成为人类获取可食用猪肉的主要方式，猪皮也可制成皮革，具有很高的经济价值，猪产业已经成为经济发展和日常生活中不可或缺的一部分［15］。PRV在国内外都有报道，且有多种PRV疫苗用于预防该病毒［16］。在临床上区分野毒感染猪和疫苗免疫猪对于近年来的猪场PRV净化工作有重要意义［17］。目前有多种方法可检测PRV，有多重RT-PCR检测技术［18］、动物接种法、血清学实验等。由于进口的PRV抗体ELISA试剂盒价格高，难以应用于大面积检测，因此开发特异、敏感、简捷且价格低廉的PRV抗体检测试剂盒十分必要。

gE蛋白是PRV的囊膜蛋白，有暴露于表面的抗原位点，其中gE是PRV主要的囊膜毒力蛋白［19］，可介导PRV与宿主细胞的融合。现有研究表明在PRV疫苗开发中，重组疫苗已成为新趋势［20－21］。由于该蛋白的基因高度保守，多数PRV缺失株缺失gE蛋白，于是本研究选取了含有gE 5个主要抗原表位区段的基因（561 bp），通过PCR的方法将PRV FA株的gE 5个主要抗原表位区段成功扩增并构建至pET-28a（+）载体上，转化原核表达菌株BL21（DE3），通过原核表达系统成功表达了融合蛋白gE-6×His。

经镍柱亲和层析后获得了纯化的融合蛋白gE-6×His；将gE-6×His与免疫佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠，建立了间接ELISA方法，以检测免疫后血清效价，融合后也用此方法筛选杂交瘤细胞。将不完全弗氏佐剂注入小鼠腹腔，1 d后向腹腔中注射杂交瘤细胞悬液，约7 d后取小鼠腹水。本试验用的小鼠腹水诱导方法更快捷，且不完全弗氏佐剂更容易引起特异性免疫应答［22］，注射后1 d即可注射杂交瘤细胞，缩短了腹水诱导的时间，与杨国平等［23－24］使用的降植烷和石蜡相比更加快速。用Western-blotting鉴定单克隆抗体，可见在约120 kDa处有1个明显条带，与吴桐［25］制备的gE单克隆抗体的条带位置相近，但本研究制备的单克隆抗体Western-boltting条带更单一，特异性更强。

本研究采用PRV-FA作为抗原包被酶标板，以gE单克隆抗体作为检测抗体，建立了PRV的竞争性ELISA检测方法，并优化了检测条件，这为开发特异、敏感、简捷且更廉价的PRV检测试剂盒奠定了基础，对当下伪狂犬病的净化工作有一定的指导意义。