“碧护”对苹果叶片衰老过程和相关抗氧化酶系统的影响

谭延肖,韩梅梅,郑现和,石 莹,徐文胜,李腾飞,杜梦扬

(德州市农业科学研究院,德州 253000)

植物生长调节剂是调节植物生长发育的化学合成物质,能在较低浓度下发挥作用,促进或抑制植物生长发育。通过刺激或抑制植物内源激素产生,调节植物生长或改变局部组织的微观结构;通过调节植物中核酸、蛋白质和酶的合成,调控植物生长的不同阶段或改变植株形态[1]。研究表明,植物生长调节剂还可以影响酚类、萜类以及含氮化合物等生物活性成分在植物体内的合成,对植物次生代谢进行调控[2]。Anastasia等[3]研究表明,扁豆植物的生长、产量、抗氧化活性和酚类物质含量都会受植物生长调节剂的影响。傅华龙等[4]指出,一些植物生长调节剂能提高植物蛋白、糖等含量,增强植物的抗寒性、抗旱性、抗盐碱性和抗虫性。其中,植物生长调节剂对果树的影响主要表现在调控营养生长和花芽分化,促进插条生根,提高果树抗逆性,影响果实的生长、成熟、品质和耐贮性等方面[5]。

“碧护”是德国科学家研制的一种植物源生长调节剂,内含赤霉素、芸苔素内酯、吲哚乙酸、脱落酸、茉莉酮酸等8种植物内源激素,10余种黄酮类催化平衡成分,20余种氨基酸和抗逆诱导剂等[6]。具有打破休眠、促进生根、强壮树体、促进坐果、改善品质、促进早熟、提高植株抗逆性等功能[7]。近年来,“碧护”在国内外被广泛应用于粮食[8]、蔬菜[9]、水果[10-12]、茶叶[13-14]、棉油[15]等作物生产中,大幅度提升了农产品的产量和品质。本研究以富士苹果叶片为试材,采用黑暗诱导方式,探究施加“碧护”对苹果叶片衰老的影响,以期为“碧护”在生产中用于调控植株衰老提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试药剂“碧护”(0.136%芸苔素·吲哚乙酸·赤霉酸)为德国阿格福莱农林环境生物技术股份有限公司生产。植物材料为栽植于试验基地内(北纬36°24′、东经115°45′)的树龄5年的红富士苹果植株。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

田间采集叶位相同、生长一致的富士苹果当年生枝条成熟叶片,自来水冲洗后,无菌水冲洗3遍,叶柄末端用脱脂棉包裹,置于温度21—23℃,空气相对湿度70%的培养箱中。试验设置对照组(CK,喷施蒸馏水)、处理组1(CL1,喷施“碧护”,原液稀释15 000倍)和处理组2(CL2,喷施“碧护”,原液稀释8 000倍),分别于光下[光照强度120 μmol∕(m2·s)]和黑暗下处理16 d,分别于0 d、4 d、8 d、12 d、16 d收集样品,-80℃保存,备用。各处理重复3次。

1.2.2 叶绿素及可溶性蛋白含量测定

叶绿素用80%丙酮萃取,测定方法参考Li等[16]。取0.5 g叶片,投入10 mL 80%丙酮中,避光浸提24 h,用UV-2550分光光度计,分别测定波长663 nm、645 nm和470 nm下的吸光值,计算叶绿素含量。

可溶性蛋白的提取和测定方法参考Bradford[17]。取0.5 g叶片,加入2%(m∕V)聚乙烯吡咯烷酮和1.0 mL 50 mmol∕L的磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.8,含1 mmol∕L EDTA-Na2和11% Triton X-100)研磨成匀浆。12 000 r∕min、4℃离心20 min,取上清,测定可溶性蛋白含量。

1.2.3 基因表达分析

PAO和SAG12基因表达水平通过实时荧光定量PCR进行检测[18]。以MpActin为内参基因,每5个处理叶片混合为1个样本,提取RNA,进行3次生物学重复。

1.2.4 H2O2和MDA含量测定

H2O2的提取和测定方法参考王平[19]。在410 nm处测量吸光值,并根据由UV-2550分光光度计获得的标准曲线计算H2O2浓度。

MDA含量测定方法参考Heath等[20]。取0.5 g叶片,加入1.5 mL预冷的0.1%(w∕v)TCA溶液充分研磨,12 000 r∕min、4℃离心20 min;取0.5 mL上清,加入1 mL 0.65%硫代巴比妥酸(TBA),沸水浴30 min;冰中终止反应,5 000 r∕min、4℃离心10 min。用UV-2550分光光度计分别测定532 nm和600 nm下的吸光值,计算MDA含量。

1.2.5 抗氧化系统相关酶活性测定

取0.5 g叶片,加入2%(m∕V)聚乙烯吡咯烷酮和1.5 mL 50 mmol∕L的磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.8,含1 mmol∕L EDTA-Na2和11% Triton X-100)研磨成匀浆。12 000 r∕min、4℃离心20 min,取上清,测定过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性,测定方法参考殷丽华[21]。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0软件进行数据处理,使用Sigma Plot软件作图,并应用独立样本的t检验对变量进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 “碧护”对黑暗诱导的苹果叶片衰老过程的影响

叶片衰老是植物发育过程中重要的生命现象,通常利用黑暗诱导离体叶片衰老[22]。由图1可知,黑暗下16 d后未喷施“碧护”的叶片已经明显失绿黄化,而喷施“碧护”的处理组叶片变化不明显。通过测定它们的叶绿素含量和可溶性蛋白含量也验证了这一现象。黑暗下处理16 d后,对照组叶片中的叶绿素和可溶性蛋白含量明显下降,而在处理组叶片中仍保持较高的水平(图2)。

图1 “碧护”对黑暗诱导苹果叶片衰老的影响Fig.1 Effects of “Bihu” on dark-induced senescence of apple leaves

图2 “碧护”对黑暗诱导苹果叶片衰老过程中叶绿素和可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effects of “Bihu” on the contents of chlorophyll and soluble protein during dark-induced senescence of apple leaves

2.2 苹果叶片衰老相关基因PAO和SAG12表达情况

PAO基因与叶绿素降解相关;SAG12是一个衰老过程特异表达的半胱氨酸蛋白酶基因。PAO和SAG12基因的表达水平在处理16 d的对照组中明显上调,而在处理组叶片中仍保持较低的水平(图3)。

图3 “碧护”对黑暗诱导苹果叶片衰老过程中PAO和SAG12基因表达的影响Fig.3 Effects of “Bihu” on the expression of PAO and SAG12 genes during dark-induced senescence of apple leaves

2.3 苹果叶片H2O2和MDA水平的变化

H2O2的积累是叶片衰老的一个表现,同时H2O2的积累也会加速叶片的衰老进程。由图4-A所示,光照条件下,对照组和处理组叶片内H2O2的积累量都保持在较低的水平,而黑暗处理诱导H2O2大量积累,但处理组叶片中积累的H2O2相对较少(图4-A)。

植物体积累的活性氧(ROS)可以直接与氨基酸、蛋白质和核酸发生反应,导致脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的增加。黑暗下,对照组和处理组叶片中MDA的含量均有明显升高,但处理组中MDA的积累量比对照组明显要低(图4-B)。这表明,喷施“碧护”可以有效缓解黑暗诱导的叶片衰老过程中膜脂过氧化损伤。

图4 “碧护”对黑暗诱导苹果叶片衰老过程中H2O2和MDA含量的影响Fig.4 Effects of “Bihu” on the contents of H2O2 and MDA in apple leaves during dark-induced senescence

2.4 苹果叶片抗氧化系统酶活性的变化

CAT、POD和APX可以促进H2O2的降解[23-24]。黑暗下,CAT、POD和APX的酶活性都出现了显著变化,然而在处理组叶片中这些抗氧化酶的活性明显比对照组高(图5)。这表明,喷施“碧护”可以影响黑暗诱导的苹果叶片衰老过程中抗氧化酶的活性。

图5 “碧护”对黑暗诱导苹果叶片衰老过程中抗氧化酶活性的影响Fig.5 Effects of “Bihu” on the antioxidant enzyme activity in the process of dark-induced apple leaf senescence

3 讨论

“碧护”作为植物生长调节剂,可有效增加土壤有益微生物菌群数量,平衡植物营养,增强根系功能,促进根系发育,进而激发植物生长潜力,解决因微量元素缺乏引起的烂根、黄叶、裂果等问题,提高其抗虫性、抗病性,进而提升作物产量和品质。“碧护”在果树上的作用主要体现在以下几方面:可以提高果树抗逆性,减轻病虫害,预防花期冻害;促进扦插生根,提高育苗成活率;促进光合作用,促发枝,增强树势;促进花芽分化,保花保果;促进果实成熟,提高商品率,延长货架期[25-26]。

本研究结果表明,施加“碧护”可以明显推迟黑暗诱导的苹果叶片衰老进程。叶绿素降解导致的叶片黄化是叶片衰老的一个重要标志。在黑暗处理16 d后喷施“碧护”,叶片仍保持较高的叶绿素和可溶性蛋白水平。前人报道了一些叶绿素降解途径的相关基因[27],PAO是其中一个关键基因,在未喷施“碧护”的对照组叶片衰老过程中该基因被强烈诱导表达,而在喷施“碧护”的叶片中该基因的上调表达明显被抑制。另外,在叶片衰老过程中有些基因的表达被特异性诱导,这一类基因被称作衰老相关基因,其中SAG12通常被视作衰老的标志性基因[28]。在本试验中,黑暗诱导下喷施“碧护”的叶片中该基因的表达明显被抑制,这也表明“碧护”的施用使得苹果叶片衰老过程被推迟。

自由基假说认为,叶片衰老的发生主要是因为大量活性氧类物质的生成所致[29]。H2O2作为稳定的自由基在很多植物叶片衰老过程中产生。在本试验中,黑暗诱导下未喷施“碧护”叶片中H2O2的积累量与喷施“碧护”的叶片相比明显较多,而H2O2清除的关键酶CAT、POD和APX的活性在喷施“碧护”的叶片中明显较高。因此,“碧护”的喷施可能参与调控植株体内抗氧化酶活性和H2O2的平衡,进而缓解黑暗诱导的叶片衰老过程中造成的氧化损伤,最终延缓了叶片衰老进程。

4 结论

植物生长调节剂“碧护”的施加有效延缓了黑暗诱导的苹果叶片衰老过程,缓解了衰老过程中叶绿素和叶片蛋白质的降解。而且,“碧护”可能通过影响抗氧化酶CAT、POD和APX的活性,提高ROS的清除能力,缓解衰老过程中的氧化损伤,保护植物细胞免受自由基的伤害。因此,“碧护”的施加对苹果叶片衰老过程具有重要作用,但是关于该植物生长调节剂参与叶片衰老过程中的具体调控机制仍需要进一步去探究。