尿外泌体中致纤维化基因表达在早期糖尿病肾病诊断中的作用研究

宋澜澜，赖丽莎，方秀珠，谢岭平，揭育帮，邓仁堂，陈载鑫，付文金

1.广东医科大学检验医学研究所，广东东莞 523808；2.广东医科大学附属厚街人民医院检验科，广东东莞 523945

随着生活水平的提高，逐年递增的早期糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）发病率已成为全球重要公共卫生问题。尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症，是导致糖尿病患者终末期肾衰竭的主要原因，也是糖尿病主要死因之一[1]。其发病机制复杂，病理改变多样，目前临床尚无有效手段能阻止DN的发生发展，DN的防治也未获得令人满意的效果[2]。早期预测和诊断是有效改善糖尿病患者的疗效和预后的关键。研究表明，肾小管损伤导致氧化应激、缺氧、慢性炎症及纤维化等改变，进而影响肾小球滤过功能，二者损伤会相互促进、加重肾脏功能恶化，共同推进DN的发生发展[3]。因此，研究高糖刺激近端肾小管上皮功能改变及其对肾脏损伤的具体机制有重大意义。

本文选取2019年5月—2020年6月于广东医科大学附属厚街人民医院住院的新诊断早期糖尿病肾病患者16例及2型糖尿病肾病患者16例，探讨尿外泌体中致纤维化基因表达在不同严重程度下糖尿病肾病以及健康人群中的基因表达情况，并对存在差异表达的miRNA的临床价值进行探讨，确定具有潜在应用价值miRNA，为DN的早期诊断提供新的可靠标志物；同时深入研究肾小管上皮外泌体miRNA表达在DN发病机理中的作用机制，亦为DN的治疗提供新靶点，为早期糖尿病肾病患者预防和治疗提供科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取于本院住院的新诊断早期糖尿病肾病患者16例及2型糖尿病肾病患者16例，将这32例患者纳入研究组，其中16例早期2型糖尿病肾病患者为研究组A组，16例2型糖尿病肾病患者为研究组B组。同时取同期到医院进行体检的健康体检者16名，纳入对照组。其中研究组A组中男7例，女9例；平均年龄（58.23±6.52）岁，平均病程（4.67±3.82）年。B组中男8例，女8例；平均年龄（55.67±5.28）岁，平均病程（6.35±3.42）年。对照组中男11例，女5例；平均年龄（54.23±5.59）岁。3组研究对象的年龄、性别、病程、吸烟史、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究均取得患者及其家属的认可，且获得伦理委员会的批准。研究组中男18例，女15例；平均年龄（58.23±6.52）岁，平均病程（4.67±3.82）年。对照组中男11例，女5例；平均年龄（54.23±5.59）岁，平均病程（1.56±1.21）年。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①符合1999年世界卫生组织糖尿病肾病诊断标准；②糖尿病病程≥3年，未接受过糖尿病肾病药物治疗；③年龄26～75岁、性别不限；④体质指数＞18.5 kg/m2。

排除标准：①1型及其他特殊类型糖尿病患者；②自身免疫性疾病、病毒性肝炎、糖尿病外代谢性疾病和高血压导致的肾脏疾病，及合并严重心肝肺疾病者。

1.3 方法

1.3.1 体外高糖刺激前期研究收集了32多例2型糖尿病患者标本，通过芯片分析技术检测近十种肾损伤标志物即外泌体miRNA，并发现部分肾小管损伤标志物可先于肾小球出现病理改变，以及血糖、TGF-β1可刺激DN患者尿液Smad1的表达。

1.3.2 血肌酐、尿白蛋白、尿钠的检测患者入院第2天空腹（入院当天22:00后禁食水，次日晨起6:00）抽取静脉血收集临床数据，生化指标由全自动生化分析仪AU5821或各种免疫法测定。

1.3.3 尿外泌体致纤维化基因表达的检测 取患者的晨尿400 mL，加入叠氮钠13.4 mL、20 mLPMSF、400 μL的亮抑蛋白,在低温短暂保留后，离心和沉淀，再通过Western Blot进行外泌体的鉴定、外泌体总mRNA的提取、转录cDNA，再采用实时定量PCR法(RT-qPCR)检测患者尿外泌体中纤维化基因（TGF-β1和CTGF）的表达，以GAPDH为内参照。引物设计与并合成分别为：TGF-β1引物 上游5-TCCTGGCGATACCTCAGCAA-3，下游5-gtagtgaacccgttgatgtcca-3,扩增产物200 bp；CTGF引物上游5-ggtgtggctttaggagcagt-3，下 游5-tgatggctggagaatgcaca-3,扩增产物247bp；GAPDH引物上游5-atcccatcaccatcttcc-3，下 游5-tgacccttttggctcccc-3，扩 增 产 物160bp。

1.4 观察指标

观察两组患者血肌酐、尿白蛋白、尿钠等的水平及对比两组患者尿外泌体中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)。CTGF的mRNA的表达等相关情况；同时统计两组患者的一般资料。

1.5 统计方法

采用SPSS 26.0统计学软件处理数据，计量资料符合正态分布，以(±s)表示，两独立样本采用t检验，非正态分布者采用两独立样本的非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者血肌酐、尿白蛋白、尿钠的水平比较

研究组A组血肌酐、尿白蛋白、尿钠水平明显高于对照组；2型糖尿病肾病B组患者的血肌酐、尿白蛋白、尿钠水平更高于早期糖尿病肾病研究组A组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3组患者血肌酐、尿白蛋白和尿钠水平对比(±s)

表1 3组患者血肌酐、尿白蛋白和尿钠水平对比(±s)

组别A组（n=16）B组（n=16）对照组（n=16）F值P值血肌酐（μmol/L）107.5±10.8141.7±31.475.4±6.210.31＜0.05尿白蛋白（mg/L）105.7±9.6141.4±35.968.9±8.69.82＜0.05尿钠［mmol/（kg·h）］238.9±29.5279.5±42.9110.6±10.721.03＜0.05

2.2 3组 患 者 尿 外 泌 体 中TGF-β1和CTGF的mRNA表达对比

研究组A组和B组患者尿液中的TGF-β1和CTGF的mRNA的表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究B组患者尿液中的TGF-β1和CTGF的mRNA表达水平明显高于研究A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3组患者尿外泌体中TGF-β1和CTGF的mRNA表达水平对比(±s)

表2 3组患者尿外泌体中TGF-β1和CTGF的mRNA表达水平对比(±s)

组别A组（n=16）B组（n=16）对照组（n=16）F值P值TGF-β1 2.2±0.84.1±1.21.0±0.23.56＜0.05 CTGF 1.8±1.13.8±1.81.1±0.33.28＜0.05

3 讨论

DN是糖尿病常见的微血管并发症，肾小管及其间质的病变，被认为是影响DN预后的重要因素，严重威胁着人类的生命健康，早期诊断是有效改善DN患者预后的关键[4]。临床上认为糖尿病肾病的发生生理机制主要有：肾小球持续性的高压、蛋白激酶以及醇化反应被激活、过度糖基化[5-6]。同时患者肾脏损害的分子机制较多，过去临床上判断糖尿病肾病的指标主要为尿白蛋白、血肌酐等，但是这些指标在敏感性方面存在缺陷。因此，探索更佳有效的早期诊断指标具有重要意义[7]。近年来的研究显示外泌体miRNA参与多种疾病的发生发展，并成为临床诊断、预后判断的重要标志物[8]。然而，DN患者中肾小管间质外泌体分泌及其miRNA是如何改变的，鲜有报道。本文通过对早期糖尿病肾病患者尿液外泌体中纤维化基因TGF-β1和CTGF的mRNA的表达情况进行研究，探索TGF-β1和CTGF的mRNA的表达对于诊断早期糖尿病肾病的意义。

激肾小管上皮细胞（HK-2细胞系），采用芯片技术检测存在差异表达的外泌体miRNA；然后对DN患者和对照组尿液检测这些外泌体miRNA，确定其在临床中的应用价值，为DN的早期诊断提供新的标志物；最后采用生物信息学技术，分析这些差异表达的肾小管外泌体miRNA在DN作用机理，为DN的治疗提供新思路[9-10]。外泌体（exosomes）是由不同细胞分泌的直径30～100 nm脂双分层的膜性囊泡，包含有来源细胞所特有的蛋白质、微小RNA（miRNA）等生物信息分子，病理与生理状态下细胞所分泌的外泌体负载的信号分子差别较大，相关分子可作为疾病诊断、干预治疗、预后评估的新型标志物[11]。miRNA是一类具有生物活性的非编码短链RNA，广泛参与个体发育、细胞增殖与凋亡等生命活动。成熟miRNA占外泌体所有RNA的41.7%，作为miRNA的富集体，外泌体是miRNA研究的可靠载体[12]。外泌体miRNA的异常表达参与多种疾病的发生发展，并成为多种疾病临床诊断及预后判断的重要标志物，近年来肾小管及其间质的病变在DN中的作用日益受到重视，被认为是影响DN远期预后的主要因素[13]。

早期糖尿病肾病的发展与细胞外基质过度的沉淀有着密切的联系，细胞外基质出现过度的沉淀就会导致人体的肾脏细胞受损，进而发展为尿毒症终末期。TGF-β1和CTGF作为纤维化基因，其基因的激活和表达能够提示患者肾病的发展情况。TGF-β1基因能够在细胞增殖、细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、免疫反应灯多个途径下对纤维化进程进行调节。当TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3处于休眠状态时，会被多种酶激活，再激活TGF-β，进而将Smad2和Smad3进行激活，被激活的Smad2和Smad3会与Smad4发生结合，再进入到细胞核内发挥基因调节的作用[14]。TGF-β1基因能够通过加快产生纤维的细胞被激活，增强相关基因的表现，促进细胞增殖、分化；其次，还可通过对肾小球细胞进行损害，导致肾小球细胞逐渐纤维化[15]。在本研究中根据采用实时定量PCR法(RT-qPCR)对人体尿液中的纤维化基因表达情况进行判断，测量TGF-β1和CTGF的mRNA的表达水平。结果显示研究组患者尿液中的TGF-β1mRNA的表达水平明显高于对照组(P＜0.05)；研究组B组2型糖尿病肾病患者尿液中的TGF-β1的mRNA的表达水平明显高于研究组A组早期糖尿病肾病患者尿液中TGF-β1的mRNA的表达水平(P＜0.05)。患者尿外泌体中TGF-β1的mRNA的表达水平与患者糖尿病肾病的严重程度呈正相关。可见在糖尿病肾病早期疾病中患者的TGF-β1水平就已经开始提高，且随着TGF-β1基因表达水平的提高，患者的糖尿病肾病病情加重[7]。

而CTGF是TGF-β1的下游细胞因子，是由肾小球上皮、间质成纤维细胞生成，具有调节细胞纤维化的功效。CTGF具有调节TGF-β基因表达的能力，进而使得细胞纤维化加重。同时CTGF可促进KLF10的生成，进而将Smad7的生成进行抑制，进而导致Smad7对TGF-β/Smad信号通路的抑制作用下降[16]。同时CTGF基因表达的水平提示患者肾脏的受损严重程度[17]。在本研究中CTGF的mRNA的表达水平明显高于对照组(P＜0.05)；研究组B组2型糖尿病肾病患者尿液中的CTGF的mRNA的表达水平明显高于研究组A组早期糖尿病肾病患者尿液中CTGF的mRNA的表 达水 平(P＜0.05)。患者 尿外 泌体中CTGF的mRNA的表达水平与患者糖尿病肾病的严重程度呈正相关。可见CTGF可作为诊断早期糖尿病肾病的指标[18]。

本研究中，研究组A组患者的血肌酐、尿白蛋白、尿钠的水平明显高于对照组(P＜0.05)；2型糖尿病肾病B组患者的血肌酐、尿白蛋白、尿钠水平更高于早期糖尿病肾病研究组A组患者(P＜0.05)。提示患者糖尿病肾病越严重血肌酐、尿白蛋白、尿钠的水平越高；在早期糖尿病肾病级别方面，患者尿外泌体中致纤维化基因表达越多，肾病病变越严重，可见患者糖尿病肾病越严重，患者血肌酐、尿白蛋白、尿钠的水平越高。同时患者尿外泌体中TGF-β1和CTGF的mRNA的表达水平能够反应出患者糖尿病肾病的情况。

综上所述，随着早期糖尿病肾病患者的疾病严重程度的增加，患者尿外泌体中TGF-β1和CTGF的mRNA表达水平越高。糖尿病肾病患者尿外泌体中致纤维化基因TGF-β1和CTGF可能是临床诊断早期糖尿病肾病及其进展的重要辅助生物学标志物。