黄腐酸对酒精所致胃溃疡小鼠胃蛋白活力的影响

陈崇莲 戴伟锋 秦 谊 李宝才 张 敉

昆明理工大学生命科学与技术学院 昆明 650500

胃黏膜损伤（Gastric mucosal damage）是一系列外源性或内源性攻击因子进入胃内刺激胃黏膜所导致的炎症反应，胃黏膜屏障功能被攻击因子侵袭及胃腺体结构受到破坏时可诱发黏膜损伤。胃黏膜受损时，胃发生一定病变如胃炎、胃溃疡，当治疗不充分时，胃炎及胃溃疡往往发展为胃癌。其中药物刺激[1～4]、幽门螺旋杆菌感染[5～7]、应激创伤[8，9]、抽烟酗酒[10，11]等往往是胃黏膜损伤的主要诱因。据世界卫生组织报告显示：消化系统疾病致死人群中，因饮酒所致的占21.3%。而全球饮酒者的比例在上升[12，13]。人们饮酒后，酒精首先与胃黏膜接触，对胃黏膜病理生理的影响十分显著[14]。大量文献研究表明，摄入浓度为14%的乙醇即可破坏胃黏膜屏障，使其形态与功能发生改变[15，16]。酒精对胃黏膜损伤明确，黏膜呈非特异性病变，目前已普遍用作动物实验模型，用于药理研究，药效评估，探讨胃黏膜急性损伤的病理生理机制[17]。

黄腐酸（FA）是腐植酸（HA）[18]中分子量较低，含氧官能团较多，水溶性最好的部分，因此也被称为“药用黄腐酸”[19]。现代药理作用研究表明：黄腐酸具有止泻[20，21]、抗氧化[22，23]、抗炎[24，25]、抗溃疡[26～29]等活性。我国河南巩义制药厂（现更名为江苏平光信谊中药有限公司）率先从煤炭中提取出黄腐酸并制成了口服液，用于治疗胃寒、胃痛、胃及十二指肠出血。

为进一步探索黄腐酸对胃黏膜损伤的保护机制，本文基于黄腐酸功效，运用酒精所致小鼠胃黏膜损伤模型，从产自黑龙江宝清（BQ）、云南弥勒（ML）和建水（JS）3 地褐煤中提取制备黄腐酸，并分析3 地煤样及黄腐酸的理化性质，测定黄腐酸对胃黏膜损伤中小鼠胃蛋白酶活力的影响，以期为探索黄腐酸保护胃黏膜机制提供研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物

1.1.1 材料

根据文献报道方法[30]，从产自黑龙江宝清、云南弥勒和建水的褐煤中提取制备了黄腐酸样品，编号分别为BQ-FA、ML-FA 和JS-FA。

1.1.2 实验动物

清洁级昆明小鼠，雄性，体重22±2 g，购自昆明医科大学实验动物中心。所有动物饲养于25 ℃环境中，白天昼夜12 h 交替，给予充足的食物，适应1 周后开始实验，所有动物实验均严格遵守动物实验伦理委员会制定的操作原则。

1.2 试剂与仪器

酒精（分析纯）、PBS 磷酸缓冲液、超纯水、胃蛋白酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）、枸橼酸铋钾胶囊（湖南华纳大药厂股份有限公司）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）、镊子、灌胃针、烧杯、电子天平、离心机、酶标仪、移液枪及枪头、EP 管。

1.3 实验溶液的配制

枸橼酸铋钾的配制：本实验规格每粒含枸橼酸铋钾0.3 g（相当于铋100 mg）。故取开胶囊壳，将胶囊溶于10 mL 纯水中，得到浓度为10 mg/mL的溶液。

黄腐酸样品的配制：准确称取BQ-FA、MLFA、JS-FA 样品400.00 mg，溶于10.00 mL 纯水中，得到40 mg/mL 的母液。

采用灌胃给药方式，给药前称重小鼠，按小鼠体重给药，所有药品灌胃时浓度按1 mL/100 g体重，均为给药当天配制。

1.4 实验方法

1.4.1 煤样及黄腐酸理化性质分析

参照文献报道方法[30]对煤样和所提取的黄腐酸进行理化性质分析。

1.4.2 黄腐酸的精制

取型号为001×7 的阳离子树脂，用去离子水进行浸泡，使其膨胀，待充分膨胀之后，去离子水清洗干净，把水分滤干，用无水乙醇浸泡大约8 h，滤干乙醇，再用去离子水清洗树脂中残留的无水乙醇，直至去离子水无黄色。用树脂体积2 ～3 倍的氢氧化钠和盐酸多次交替浸泡去离子水清洗，直至树脂呈中性为止，确保树脂中不含有氯离子。然后称取黄腐酸溶解在去离子水里，将溶液的pH 值调节到5，待溶液充分溶解之后，将其放置到4 ℃的冰箱静置过夜，约12 h，取出溶液，离心，保留黄腐酸上清液，将上清液循环上样，旋蒸浓缩至黏稠状，将其转移至瓷盘中，再将其放入到冷冻干燥器中冷冻干燥，得到精制黄腐酸。宝清、弥勒、建水3 地的黄腐酸精制方法一致。

1.4.3 胃蛋白酶活力测定

48 只小鼠正常喂食适应1 周，随机分为6 组，每组8 只，分别为空白对照组（未用酒精处理，正常组）、模型组（灌胃酒精0.5 mL/100 g）、阳性药组（灌胃枸橼酸铋钾）、实验组（灌胃BQ-FA、ML-FA 和JS-FA）。采用灌胃方式，每日9 时进行，阳性药组每日给予100 mg/kg 枸橼酸铋钾，连续1 周；实验组每日分别给予剂量为400 mg/kg 的3 种黄腐酸样品，连续1 周；空白对照组和模型组每日分别给予同等剂量的生理盐水，连续1 周。末次给药前禁食不禁水12 h；第7 天，同上述灌胃后禁水，1 h 后，除空白对照组予0.5 mL/100 g 生理盐水外，其余各组小鼠均给予剂量为0.5 mL/100 g的酒精；1 h 后，将所有试验小鼠脱颈处死，剥离胃组织，沿胃大弯将其剖开，用预冷PBS 磷酸缓冲液清洗胃内容物，放-80 ℃备用。

1.5 BCA（Bicinchoninic acid）法蛋白定量

1.5.1 组织样本前处理

取各组小鼠胃组织，胃组织表面的水分用滤纸吸干。称取各个组织的相同部分，与PBS 磷酸缓冲液一起匀浆，组织重量（g）：生理盐水（mL）为1 ∶9，放入3 mm 研磨珠2 颗，4 mm 研磨珠1 颗于研磨仪中4 ℃下研磨40 s 2 次，使组织彻底匀浆化，制成10%的组织匀浆，转移至离心管中，于2500 rpm，4 ℃下离心10 min，取上清液备用。

1.5.2 标准曲线的建立和样品蛋白浓度的测定

蛋白标准品的准备：BCA 蛋白浓度测定试剂盒中取出蛋白标准品稀释液完全溶解蛋白标准品，取蛋白标准品10 μL，用蛋白标准品稀释液稀释至100 μL，使终浓度为0.5 mg/mL。

BCA 工作液配制：根据样品数量，按BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书，取50 体积BCA 试剂A加1 体积BCA 试剂B（50 ∶1）配制适量BCA 工作液，充分混匀。

蛋白浓度测定步骤如下：

a.将标准品按0、2、4、8、12、16 μL 加到96 孔板的标准孔中，加标准品稀释液补足到20 μL，相当于标准品浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL。

b.加10 μL 小鼠胃组织样品到96 孔板的样品孔中，再加10 μL PBS 磷酸缓冲液补足20 μL。

c.各孔加入200 μL BCA 工作液，37 ℃放置30 min。

d.用酶标仪在562 nm 测定，记录OD 值。

e.根据标准曲线和样品体积计算出样品的蛋白浓度。

1.6 小鼠胃组织中胃蛋白酶活力检测

本实验采用胃蛋白酶活力试剂盒检测小鼠胃组织中胃蛋白酶活力，具体操作如下：

（1）从-80 ℃冰箱取出小鼠胃组织，解冻平衡至室温。

（2）从4 ℃冰箱取出胃蛋白酶试剂盒平衡至室温。

（3）准确称取胃组织重量，按胃组织重量（g）∶6 号匀浆介质（胃蛋白酶活力试剂盒所带试剂）体积（mL）=1 ∶9 的比例，放入3 mm 研磨珠2 颗，4 mm 研磨珠1 颗，4 ℃下于研磨仪中研磨40 s 2 次，使组织彻底匀浆化，制成10%的组织匀浆，转移至离心管中，于2500 rpm，4 ℃下离心10 min，取上清液预试后按以下操作测定胃蛋白酶活力。

（4）设置测定管和对照管，酶促反应按表1步骤操作。

表1 酶促反应操作步骤Tab.1 Operation steps of enzymatic reaction mL

将酶促反应所加试剂充分混匀，37 ℃水浴10 min，3500 rpm，离心10 min，取上清液0.3 mL进行显色反应，操作步骤见表2。

表2 显色反应操作步骤Tab.2 Operation steps of color reaction mL

将显色反应中所加试剂充分混匀，37 ℃水浴20 min，波长660 nm，光径1 cm，蒸馏水调零，测定各管吸光度OD 值。

胃蛋白酶活力的计算公式如下：

组织中胃蛋白酶活力（U/mg prot）=（测定OD值-对照OD 值）/（标准OD 值-空白OD 值）×标准品浓度（50 μg/mL）/反应时间（10 min）×（反应液总体积/ 取样量）/ 待测样本蛋白浓度（mg prot/mL）。

1.7 数据分析

使用SPSS 23.0 统计软件进行数据处理，各组数据以x±s 的形式表示，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异，组间比较用方差分析（LSD 法）。统计图使用Graphpad prism 8.0 软件制作，P＜0.05 时认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 煤样及黄腐酸理化性质分析

宝清、弥勒和建水褐煤及其所制备黄腐酸的理化性质如表3、表4 所示。由统计学分析结果可知，3 地褐煤水分、碳含量、黄腐酸得率无显著性差异（P＞0.05）；而各地褐煤中灰分、总腐植酸含量、游离腐植酸含量、黄腐酸中灰分、精制后黄腐酸灰分存在显著性差异（P＞0.05）；值得注意的是，3 地黄腐酸精制后的灰分含量比精制前下降明显。

表3 煤样理化性质分析Tab.3 Analysis of physicochemical properties of coal samples %

表4 黄腐酸理化性质分析Tab.4 Analysis of physicochemical properties of fulvic acid

2.2 胃组织中蛋白含量的测定

根据上海碧云天生物技术研究所的BCA 蛋白定量试剂盒说明书中的操作步骤，得到蛋白含量标准曲线（图1）方程为：Y=0.6320X+0.1354（R2=0.9927）。根据标准曲线计算得各组10%胃组织匀浆的蛋白含量（表5）。

图1 蛋白含量标准曲线Fig.1 Standard curve of protein content

表5 各组小鼠10%胃组织匀浆蛋白含量（n=8）Tab.5 The protein content of 10% gastric homogenate of mice in each group (n=8) mg/mL

2.3 胃组织中胃蛋白酶活力的测定

根据试剂盒说明，测定了各组胃组织匀浆中的胃蛋白酶活力。由图2 可知，与空白对照组对比，模型组胃蛋白酶活力显著升高，阳性药组和各实验组均有下降趋势，且有显著性差异（P＜0.05），推测黄腐酸发挥保护胃黏膜的作用可能与抑制胃蛋白酶活性有关。JS-FA 组与模型组相比，有下降趋势，但无显著性差异，这可能是因为提取的褐煤产地不同造成的黄腐酸成分和药效有一定差异。

图2 小鼠胃蛋白酶活力测定结果（n=6）Fig.2 Determination results of pepsin activity in mice (n=6)

3 讨论

胃黏膜损伤是侵袭因素与胃黏膜防御能力之间失去平衡导致的结果[31]。临床上常以胃蛋白酶活力水平，作为胃粘膜损伤的评价指标，一般胃蛋白酶活力偏高，则提示胃黏膜发生了损伤。如前文所述，饮酒是引起胃黏膜损伤最常见的原因[13]。本实验选取了胃蛋白酶活力作为观察指标，研究酒精诱导型胃黏膜损伤小鼠胃蛋白酶活性的影响。实验结果表明，BQ-FA、JS-FA、ML-FA 均可使酒精所致的胃溃疡小鼠胃蛋白酶活性降低，推断这可能是黄腐酸保护胃黏膜功能的作用机制之一。受试样品中，BQ-FA 组和ML-FA 组效果较好（P＜0.05）；而JS-FA 组与模型组相比，虽有一定效果但并无显著性差异（P＞0.05），这可能是提取黄腐酸所用褐煤产地、成煤植物不同，导致黄腐酸呈现的药理活性并不完全相同。本实验说明黄腐酸对酒精型胃黏膜损伤的保护作用可能与降低胃蛋白酶活力有关。黄腐酸能降低酒精诱导而升高的胃蛋白酶活力的作用机制可能与枸橼酸铋钾相似，即黄腐酸能够在胃黏膜损伤表面或肉芽组织处形成一种坚固的保护性薄膜与胃蛋白酶发生螯合，使胃蛋白酶失活，隔绝酒精对胃黏膜的侵蚀作用，阻断酒精对胃黏膜的损伤。这种作用机制也可能与黄腐酸的胶体性质息息相关，有待进一步研究。