基于Nrf2/ARE 信号通路研究芪黄补肾泄浊方对糖尿病肾病HMC 细胞的保护机制

金丽霞，张晓东，潘 超，栾仲秋，宋淑娟，尹丽颖，王文凯

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150006）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最重要且最多见的合并症，数据显示45%左右的1 型糖尿病、30%左右的2 型糖尿病患者会出现糖尿病肾病［1］，被称为是导致慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因［2］。现代医学对其发病机理的研究仍不明确，除了包括糖脂代谢紊乱、血流动力学因素，遗传背景、免疫炎症反应等多方面因素外，糖尿病病人体内氧化应激水平明显增高已被大量研究证明，具有丰富血管系统的肾脏，最容易受到氧化应激的损伤，是氧化应激的靶器官之一。氧化应激可直接损害足细胞、系膜细胞和内皮细胞，或间接地激活其他致病途径造成伤害，进而促进DN 的发 生 和 发 展［3，4］。DN 主 要 病 理 特 征 是 以 肾 小 球 肥大、硬化，肾小管损伤、纤维化形成为主［5］。已有研究［6］表明机体内存在一套复杂的系统可以抵抗氧化应激损害，核因子E2 相关因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）是其中最重要的一条信号通路。当人体受到氧化应激刺激时，会产生一系列保护性蛋白保护细胞。在正常状态下，细胞溶质阻遏物Kelch样ECH 相关蛋白1（Keap1）将Nrf2 保留在细胞质中并促进其泛素化，与活性氧（ROS）形成动态平衡［7］。在高糖状态下，由于ROS 生成过多会引起氧化应激反应［8］，Nrf2 脱离Keap1 转运到细胞核内，与Maf 蛋白构成异二聚体，与其靶基因的启动子区域中的ARE 结合，编码其下游的抗氧化剂、第二解毒酶和相关蛋白的基因，包括超氧化物歧化酶（SOD）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS），从而提高细胞抗氧化应激的能力。国内外研究发现，激活Nrf2-ARE 信号通路可减轻糖尿病小鼠肾小球氧化应激损伤，延缓肾纤维化，起到肾保护的作用［9-13］。但中药复方对调控该通路防治糖尿病肾病的分子机制仍有待进一步研究。

芪黄补肾泄浊方主要包括黄芪、酒蒸大黄、菟丝子、猫须草、丹参、积雪草、生牡蛎、淫羊藿、蒲公英等中药，是临床多年应用总结的经验方，可有效减少DN 患者蛋白尿，改善肾功能。本课题组前期研究［14］发现芪黄补肾泄浊方可干预Nrf2 及下游相关蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）的表达以减轻氧化应激的损伤。γ-GCS 和SOD 同样作为Nrf2 下游非常重要的抗氧化蛋白，推测芪黄补肾泄浊方可以调控Nrf2 及其下游蛋白γ-GCS 和SOD，改善DN 氧化应激状态，具有成为临床治疗相关疾病新靶点的潜能。本研究旨在为早期临床干预治疗DN 提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、动物和试剂

人肾小球系膜细胞（HMC，上海富衡生物科技有限公司），Wistar 大鼠（黑龙江中医药大学药物安全性评价中心SYXK（黑）2013-010）。厄贝沙坦（安博维，杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司批号H20040494，）。芪黄补肾泄浊方由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备。SOD1（Wanleibio，中国，货号WL01846），γ-GCS（Wanleibio，中国，货号DF8550），生物素标记山羊抗兔IgG（Beyotime，中国，货号A0277），DAB 显色液（Solarbio，中国，货号DA1010），苏木精（Solarbio，中国，货号H8070），山羊血清（Solarbio，中国，货号SL038），辣根酶标记链酶亲合素（Beyotime，中国，货号A0303）。

1.2 制备血清

60 只Wistar 大 鼠，喂 养1 周 后，随 机 分 为4 组，即：对照组、高糖组、厄贝沙坦组、芪黄补肾泄浊方组。厄贝沙坦组、芪黄补肾泄浊方组分别给予厄贝沙坦（按照13.5 mg·kg-1·d-1配制1.35 mg/mL 的厄贝沙坦）、芪黄补肾泄浊方（0.324 g·kg-1·d-1）灌胃。对照组、高糖组则给予等体积的生理盐水灌胃。所有大鼠每日灌胃1 次，连续7 d，于末次灌胃2 h 麻醉，经腹主动脉采血，灭活补体，过滤、灭菌，分装后保存在-80 ℃以便后用。

1.3 HMC 培养与分组

4～5 代HMC 细胞株分别用含10% FBS、不含FBS 的RPMI1640 培养基，在37 ℃、5% CO2条件下，传代24 h。将细胞随机分成4 等份：对照组、高糖组、厄贝沙坦组、芪黄补肾泄浊方组。对照组在含10% 正常大鼠血清的培养基培养，高糖组在含10% 正常大鼠血清的高糖培养基培养，厄贝沙坦组与芪黄补肾泄浊方组在含10%对应药物的含药大鼠血清的高糖培养基（30 mmol/L 葡萄糖）中培养，培养48 h，用于实验后细胞生成蛋白提取及指标检测。

1.4 Real-time PCR 定量分析的方法检测各组细胞Nrf2、γ-GCS 与SOD 的mRNA 表达

提取各组HMC 中总RNA 后，遵照说明书进行反转录获得cDNA，并在PCR 仪器上扩增。添加试剂，放入荧光定量PCR 仪内进行反应，收集荧光定量数据并分析，以ACTIN 为内参照。引物序列设计见（表1、2）。

表1 目的基因引物序列Tab 1 primer sequence of target genes

表2 总引物序列Tab 2 Total primer sequences

1.5 Western blot 测定各组系膜细胞中γ-GCS、SOD 蛋白的表达

提取细胞蛋白质，将蛋白提取物放入PBS 缓冲液，按1∶19 混匀制备成蛋白质待测液。BCA 反应：将A 液∶B 液体积比50∶1 配制好，加入各孔中，充分混匀后，放于37 ℃环境下，反应20 min，溶液由绿色变为紫色。扫描胶片，用Gel-Pro-Analyzer 软件分析光密度值。

1.6 免疫细胞化学法检测γ-GCS、SOD 的表达

0.1% TritonX-100 孵育，3%过氧化氢孵育，血清封闭，一抗孵育，二抗孵育，辣根酶标记，DAB 显色，苏木素复染，镜检。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 Real-time PCR 定量分析的方法检测各组系膜细胞Nrf2、γ-GCS、SOD 的mRNA 表达水平

实时定量PCR 结果显示：各组HMC 培养48 h后，对照组中Nrf2、γ-GCS、SOD的mRNA 有一定的表达，与对照组相比，高糖组48 h 可见细胞内Nrf2、γ-GCS、SODmRNA 表达减少（P＜0.05）；与高糖组比较，厄贝沙坦组与芪黄补肾泄浊方组细胞中Nrf2、γ-GCS、SODmRNA 的 表 达 上 调（P＜0.05），且以芪黄补肾泄浊方组增多更明显（P＜0.05）（表3，图1）。

图1 各组HMC 48 h 末Nrf2、γ-GCS、SOD mRNA 表达相对值比较Fig 1 Comparison of relative values of Nrf2，γ-GCS and SOD mRNA expression after 48 h of HMC culture among different groups

表3 各组HMC 48 h 末Nrf2、γ-GCS、SOD mRNA 表达相对值比较（±s，n=8）Tab 3 Comparison of relative values of Nrf2，γ-GCS and SOD mRNA expression after 48 h of HMC culture among different groups（±s，n=8）

表3 各组HMC 48 h 末Nrf2、γ-GCS、SOD mRNA 表达相对值比较（±s，n=8）Tab 3 Comparison of relative values of Nrf2，γ-GCS and SOD mRNA expression after 48 h of HMC culture among different groups（±s，n=8）

注：与对照组相比，#P＜0.05；与高糖组相比，*P＜0.05。

组别对照组高糖组厄贝沙坦组芪黄补肾泄浊方组SOD 0.99±0.06 0.60±0.04#1.37±0.09*2.42±0.20*344.401 0.000 F P Nrf2 0.99±0.08 0.52±0.05#2.55±0.21*3.51±0.31*394.166 0.000 γ-GCS 0.97±0.10 0.48±0.04#1.63±0.15*2.73±0.25*300.249 0.000

2.2 Western blot 测定各组系膜细胞中γ-GCS、SOD 蛋白的表达

Western blot 结果显示：各组HMC 培养48 h后，高糖组与对照组相比γ-GCS、SOD 相对表达量明显减少（P＜0.05）；厄贝沙坦与芪黄补肾泄浊方干预后，与高糖组比较，厄贝沙坦组与芪黄补肾泄浊方组表达均有所增高（P＜0.05），表明γ-GCS、SOD蛋白表达上调。且以芪黄补肾泄浊方组上调最明显（P＜0.05）（图2、3，表4）。

表4 各组HMC 48 h末γ-GCS、SOD 蛋白的表达相对值比较（n=8，±s）Tab 4 The relative values of γ-GCS and SOD protein expressions of HMC in each group at 48 h（n=8，±s）

表4 各组HMC 48 h末γ-GCS、SOD 蛋白的表达相对值比较（n=8，±s）Tab 4 The relative values of γ-GCS and SOD protein expressions of HMC in each group at 48 h（n=8，±s）

注：与对照组相比，#P＜0.05；与高糖组相比,*P＜0.05。

组别γ-GCS/β-actin SOD/β-actin对照组0.26±0.02 0.40±0.04高糖组0.17±0.02#0.20±0.01#厄贝沙坦组0.41±0.03*0.75±0.05*芪黄补肾泄浊方组0.65±0.06*1.10±0.13*F P 249.450 258.476 0.000 0.000

图2 Western blot 测定48 h 末各组HMC 中γ-GCS、SOD蛋白的表达Fig 2 The expressions of γ-GCS and SOD proteins in HMC of all groups at the end of 48 h were determined by Western blot

2.3 免疫细胞化学法检测γ-GCS、SOD 的表达

免疫细胞化学检测结果显示：各组HMC 培养48 h 后，高糖组与对照组相比γ-GCS、SOD 表达量明显减少（P＜0.05）；厄贝沙坦与芪黄补肾泄浊方干预后，与高糖组比较，厄贝沙坦组与芪黄补肾泄浊方组表达均有所增高（P＜0.05），表明γ-GCS、SOD 表达上调。且以芪黄补肾泄浊方组上调最明显（P＜0.05）（图4）。

图4 免疫细胞化学法检测48 h 末各组HMC γ-GCS、SOD 表达结果Fig 4 The expression levels of HMC γ-GCS and SOD at 48 h by immunohistochemistry

图3 各组HMC 48 h 末γ-GCS、SOD 蛋白的表达Fig 3 The expressions of γ-GCS and SOD proteins in HMC of all groups at 48 h

3 讨论

糖尿病肾病是临床常见病，症状比较隐匿，早期可表现为尿白蛋白排泄率升高，症状不典型，容易被忽视，如早期未发现，未得到有效控制病情会迅速进展，一旦出现持续性蛋白尿，将不可避免地进展为终末期肾病［15］。虽然糖尿病肾病的发病机制在现代医学中还没有明确的认识，但是近年来很多相关研究表明，在DN 发生、发展的过程中，氧化应激和炎症反应起着十分重要的作用［4］。氧化应激是指体内氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡状态［16］。正常生理情况下，体内ROS 的产生与清除处于动态平衡。糖尿病状态下，ROS 过量产生，机体抗氧化能力下降［17］，氧化应激不仅直接攻击DNA、对蛋白质或脂质进行氧化修饰还可以激活各信号通路破坏肾组织清除自由基的能力［18］，使肾组织的形态和功能发生改变，最终形成小管间质纤维化和蛋白尿［3］，继而发展为DN。人机体内存在着一套防御机制应对自由基和毒物质的损害，其原理是一套复杂的抗氧化应答机制。这套抗氧化应答机制中最重要的一条通路是Nrf2-ARE，其抗氧化应激、保护肾功能的作用已被大量实验研究证明。ARE 作为细胞保护蛋白基因上的启动子结合序列，可以被转录因子Nrf2 激活，该过程在生理状态下相对稳定，应激状态下Nrf2 转入细胞核识别并与ARE 结合，形成Nrf2-ARE 通路，进一步产生SOD、γ-GCS 等抗氧化蛋白发挥其抗氧化应激作用，改善肾脏病理学的改变和糖脂代谢紊乱，同时可抑制ROS 蓄积导致 的 肾 脏 炎 症 反 应［19，20］。SOD 是 体 内 主 要 的 抗 氧化酶，也是评估氧化应激的一个重要指标。SOD 可通过促使超氧阴离子自由基发生歧化反应，阻断其损伤肾细胞膜性结构，发挥抗氧化作用［21］。γ-GCS是体内还原型谷胱甘肽（GSH）合成的一种限速酶，在Nrf2-ARE 通路众多的下游蛋白中最受关注，其含量与活性直接决定GSH 合成速度与数量，GSH数量的增加可使机体抗氧化应激的能力进一步增强［22］。所以调控Nrf2-ARE 信号通路，促进SOD、γ-GCS 的转录应对氧化应激，可能成为治疗DN 的新靶点。

在本研究中，通过观察高糖培养下人肾小球系膜细胞Nrf2-ARE 信号通路的Nrf2 及其下游抗氧化蛋白γ-GCS、SOD mRNA、蛋白的表达程度，以完善芪黄补肾泄浊方减轻氧化应激，防治糖尿病肾病进展的分子机制。本研究结果显示：Western blot 及免疫细胞化学结果显示正常大鼠血清培养液培养的人肾小球系膜细胞的γ-GCS、SOD 少量表达。加入高糖刺激后其表达减少明显，加入厄贝沙坦及芪黄补肾泄浊方药物血清后可不同程度的增加γ-GCS、SOD 的表达。Real-time PCR 结果显示：厄贝沙坦及芪黄补肾泄浊方γ-GCS、SODmRNA 的表达相对高糖组可有不同程度的提高。无论从基因层面还是蛋白层面，药物干预后，SOD 及γ-GCS 的表达增高，且以芪黄补肾泄浊方组明显。

综上所述，氧化应激反应可促进DN 发生、发展，芪黄补肾泄浊方可调节高糖培养下HMC 中Nrf2、γ-GCS 及SOD mRNA 及蛋白的表达，减轻氧化应激对细胞的损伤。因此我们推测芪黄补肾泄浊方可干预Nrf2-ARE 信号通路，促进抗氧化蛋白的产生，减轻氧化应激反应，从而保护肾脏，延缓DN 进展。为芪黄补肾泄浊方临床应用，早期干预DN，提供实验依据。

糖尿病肾病的发病机制复杂，本实验初步探讨了中药复方干预Nrf2-ARE 信号通路及其相关蛋白抗氧化应激的机制，接下来将进一步深入研究糖尿病肾病及其相关信号通路，并用中药复方进行干预。为中药防治糖尿病肾病提供更多的理论依据。

作者贡献度说明：

金丽霞、王文凯：全程参与、指导实验操作并撰写论文；张晓东、潘超：饲养动物，检测实验相关指标，数据统计分析，参与论文撰写；栾仲秋、宋淑娟、尹丽颖：进行免疫组化、Western Blot、Real-time PCR 法检测相关指标及数据统计。

所有作者声明不存在利益冲突关系。