Wnt/β-catenin信号调节对毛囊干细胞定向分化的影响

周汝楠，段明玥，王一硕，罗皓文，陈梦怡，闫佳乐，陈 杰

（1.西安医学院第二临床医学院麻醉系，陕西 西安 710000；2.西安医学院第二附属医院医疗美容科，陕西 西安 710000）

毛囊干细胞（hair follicle stem cells，HFSC）的发现和体外培养方法的发展为烧伤皮肤的组织工程治疗提供了可能[1]。HFSC是一种多能干细胞，具有多向分化潜能[2]。HFSC的增殖和分化能力都受自身基因和外界信号的影响。研究证实[3，4]，Wnt/β-catenin信号通路在毛囊的发育过程中起着至关重要的作用，Wnt是胚胎毛囊发育过程中最早表达的信号分子，Wnt蛋白与其受体结合可激活Wnt/β-catenin信号通路，导致β-catenin在细胞质中积聚，β-catenin与淋巴增强因子-1（LEF1）结合可激活靶基因，加速HFSC的定向分化[5]。化学物质（如LiCl）和角质形成细胞生长因子（KGF）也可导致HFSC分化，但具体机制尚不明确。本研究旨在探讨角质形成细胞生长因子（KGF）和LiCl在毛囊干细胞分化过程中对Wnt/β-catenin信号通路功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 组织收获与细胞分离 无菌条件下取新鲜人头皮标本，用含5%青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗；去除皮下脂肪组织和杂质后，将皮肤切成4 mm×2 mm的小块，放入含有0.25%分散酶的离心管中，4 ℃下消化过夜；然后沿毛发生长方向轻轻拔出毛囊，用PBS洗涤去除皮下油脂，加入60 mmol/L培养皿中，添加含10%胎牛血清（FBS）DMEM培养基（HyClone）；用2.5 g/L胰蛋白酶和0.04% EDTA在37 ℃下孵育10 min，分离毛囊隆起区，然后以5×107个/L的密度离心再悬浮于K-SFM培养液，细胞在37 ℃、5% CO2的加湿箱中孵育。每隔3～4 d更换培养液1次，培养传代3次后用于所有实验。

1.2 LiCl和KGF的处理及各蛋白检测方法 将HFSC悬浮于K-SFM培养基（不含胎牛血清）中，以1×105个/ml的浓度接种于100 mmol/L培养皿中。然后将10 mmol/L LiCl或10 μg/L KGF浓度加入培养基中，逆转录聚合酶链反应检测培养3、5、7、9 d后腺瘤性大肠息肉（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β)、轴蛋白（Axin）及淋巴增强因子1（LEF1）mRNA的表达。未治疗组作为对照组。

2 结果

2.1 HFSC生长特性 毛囊突起的原代细胞呈椭圆形，体积小，大小均匀，活细胞光学透明，边界清晰，可见一簇簇未分离的细胞。培养初期细胞黏附和活性较弱，培养1～3 d后观察到少数HFSC贴壁，多数仍保持悬浮状态（图1A、图1B）；培养4～6 d后培养皿上附着少量单个细胞或细胞团，呈鹅卵石状，排列整齐，折射率高。细胞数量随着培养时间的增加而增加（图1C、图1D）；培养2周后，可观察到一些老化的细胞。

图1 HFSC的原代培养情况（×40）

2.2 LiCl及KGF对Wnt/β-catenin信号通路组分基因表达的影响 经10 mmol/L LiCl处理后，β-catenin、APC及LEF1 mRNA表达逐渐升高，Axin和GSK-3β mRNA表达逐渐降低（图2）；经10 μg/L KGF处理后，β-catenin mRNA相对表达量没有明显改变，但GSK-3β和LEF1 mRNA的表达逐渐下降（图3）。

图2 10 mmol/L LiCl对β-catenin、APC、GSK-3β、Axin及LEF1 mRNA表达的影响

图3 10 μg/L KGF对β-catenin、APC、GSK-3β、Axin及LEF1 mRNA表达的影响

3 讨论

HFSC是在人的毛囊外根鞘隆突部中的一种，属于成体干细胞，在体内处于静止状态，在体外培养作用下具有较强的增殖能力。研究发现[6]，HFSC具有多向分化潜能，可分化成表皮、毛囊、皮脂腺，参与皮肤创伤愈合的过程。影响毛囊干细胞增殖和分化的主要内在调控因子是Wnt、β-catenin和Notch和Exit domain A信号通路，外在信号主要包括有丝分裂原、细胞间相互作用、碱性成纤维细胞生长因子或表皮生长因子等细胞生长因子[7，8]，此外，部分化学物质（如LiCl）等信号构成了HFSC增殖分化的外部微环境。KGF是成纤维细胞生长因子（FGF）超家族的成员，可调节各种细胞类型的增殖和分化。当皮肤受损时，基质细胞中KGF的表达急剧上调，促进HFSC的增殖[9]。本研究从毛囊隆起中分离出HFSC，探讨10 mmol/L LiCl、10 μg/L KGF对HFSC分化的影响。

本研究结果显示，经10 mmol/L LiCl处理后，β-catenin、APC及LEF1 mRNA表达逐渐升高，Axin和GSK-3β mRNA表达逐渐降低。分析认为，LiCl作为关键的Wnt信号激动剂，可抑制GSK-3β的活性。丝氨酸-9处的GSK-3磷酸化可阻止GSK-3β降解β-catenin，从而上调β-catenin的表达。β-catenin的表达与β-catenin-Axin-Apc-GSK-3β复合物呈正相关，而与GSK-3β和Axin水平呈负相关。Axin是Wnt信号通路的关键负调控因子，是β-catenin降解复合物的关键成分，具有多个蛋白质相互作用结构域，在各种蛋白质复合体中起支架蛋白的作用[10-12]。Axin使GSK-3β接近β-catenin，并调节磷酸化β-catenin的降解。本研究表明，LiCl可抑制GSK-3β mRNA的表达，从而抑制轴蛋白复合体的形成，从而间接上调β-catenin的水平。LEF1是Wnt信号通路中的重要转录因子，该基因编码的蛋白质可以与T细胞受体α增强子中的功能重要位点结合，可能在毛细胞分化和毛囊形态发生中发挥作用。LiCl处理使β-catenin和LEF1 mRNA水平随培养时间的延长而升高，可能是由于β-catenin复合体与LEF1的蛋白水平升高所致。在10 μg/L KGF处理的细胞中，随着HFSC的分化，β-catenin的表达在第7天略有增加，而GSK-3β的表达略有下降，LEF1水平在早期即下降，显示角质细胞生长因子的干预作用与GSK-3β对Wnt/β-catenin途径由活化转为抑制的过程尚未明确，但说明KGF与LEF1呈负相关，在初始阶段可抑制毛囊分化与形成[13-16]。

综上所述，分离培养的毛囊干细胞在体外经多次传代后仍具有一定的增殖能力和多向分化潜能。LiCl与KGF均可激活Wnt/β-catenin信号通路，改变β-catenin的表达，进而促进毛囊干细胞分化。