苹果多酚通过调控Keap1/Nrf2通路减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤*

汤建华， 詹旭莉， 冯 平， 张志华△

（1河北北方学院附属第一医院药学部，河北 张家口 050051；2河北北方学院附属第一医院呼吸科，河北 张家口 050051）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是多种因素导致肺组织发生病理改变的临床综合征［1］。该疾病的临床表现是急性发作、进行性低氧血症和胸部X光片上的双侧肺浸润［2］。尽管为寻找潜在的治疗策略付出了相当大的努力，但保护性通气策略、限制性液体管理和抗生素应用仍是ALI 患者唯一可用的治疗选择。然而，这些措施在降低ALI 患者的高死亡率方面效果有限［3］。因此，进一步探索ALI的潜在治疗方法是必要且紧迫的。苹果多酚（apple polyphenols，AP）是一种从未成熟苹果中提取的化合物，其具有抗氧化和抗炎特性［4］。据报道，AP 能够改善大鼠低氧性肺动脉高压［5］。提示AP 对肺具有保护作用。而AP 对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导大鼠ALI 的影响鲜有报道。Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白 1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核转录因子 E2 相关因子 2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）通路被认为是最关键的内源性抗氧化应激通路之一，是炎症相关疾病的重要靶点［6］。相关研究表明，激活Keap1/Nrf2 通路可减轻LPS 诱导的小鼠 ALI［7］。而 AP 能否通过调控 Keap1/Nrf2 通路对LPS 诱导大鼠ALI 发挥作用尚不明确。因此，本研究主要探究AP 对LPS 诱导大鼠ALI 的影响以及其作用机制。

材料和方法

1 动物

72 只体质量为 140～160 g 的 6 周龄 SPF 级雄性SD 大鼠购自广州锐格生物科技有限公司，生产许可证号为SCXK（粤）2021-0059。所有动物实验得到本院动物伦理委员会的批准。

2 主要试剂

AP、Nrf2抑制剂ML385购自上海源叶生物公司；LPS 购自北京伊塔生物公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）购自北京索莱宝科技公司；大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒购自上海广锐生物公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒购自上海远慕生物公司；细胞核蛋白提取试剂盒购自上海联硕生物公司；兔源1 抗Keap1、Nrf2、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、GAPDH、histone、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗均购自Abcam。

3 主要方法

3.1 ALI 大鼠模型的构建 参照文献［8］复制ALI 大鼠模型，简言之，利用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠固定于手术台上，剪开皮肤，暴露气管，向气管内缓慢注射5 mg/kg LPS以构建ALI模型。

3.2 动物分组及给药处理 按照随机数字表法将72只大鼠随机分为对照（control）组、模型（model）组、低剂量AP（low-dose AP，AP-L）组、高剂量 AP（highdose AP，AP-H）组、DEX 组、AP-H+ML385 组，每组12只。AP-L组、AP-H 组［9-10］、DEX 组［11］大鼠分别腹腔注射25 mg/kg AP、100 mg/kg AP、5 mg/kg DEX，而APH+ML385组［12］大鼠需同时腹腔注射100 mg/kg AP 和30 mg/kg ML385，control 组、model组大鼠腹腔注射等量的生理盐水，每天腹腔注射给药1 次，持续给药14天。末次给药1 h 后，除control 组外，其它组大鼠均采用向气管内注射5 mg/kg LPS 的方法构建ALI 模型，control 组大鼠的气管内注射等体积的生理盐水，造模24 h后，麻醉大鼠，收集每组大鼠肺泡灌洗液用于细胞总数、中性粒细胞数的检测，收集每组全部大鼠血清用于TNF-α、IL-6 水平的检测。肺泡灌洗液、血清收集完毕后，处死大鼠，收集大鼠肺组织，分为3部分（每部分包含每组4 只大鼠肺组织），一部分用于HE 染色，一部分用于肺组织湿重（wet weight，W）/干重（dry weight，D）比的检测，剩余一部分用于氧化应激指标、RT-qPCR、western blot实验检测。

3.3 肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞数的检测 向大鼠气管内注射1 mL 预冷的PBS 灌洗肺泡，重复灌洗3 次，肺泡灌洗液的回收率达75%，将肺泡灌洗液在 4 ℃下以 250 ×g离心 10 min，收集细胞沉淀，将细胞沉淀用PBS 悬浮，利用细胞计数板计数总细胞数。将细胞沉淀涂片，进行瑞氏染色后对中性粒细胞进行计数。

3.4 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α和IL-6水平严格按照试剂盒说明书检测大鼠血清中TNF-α 和IL-6水平。

3.5 HE 染色检测各组大鼠肺组织病理损伤情况将各组大鼠的右侧肺组织在4%多聚甲醛中固定过夜。经包埋、切成4 μm 厚的切片后进行HE 染色。在光学显微镜下观察肺组织病理损伤，并进行病理评分，评分标准［13］：0 分为无病理损伤；1 分为≤25%的肺组织存在病理损伤；2分为＞25%且≤50%的肺组织存在病理损伤；3分为＞50%且≤75%的肺组织存在病理损伤；4分为＞75%的肺组织存在病理损伤。

3.6 大鼠肺组织W/D 的检测 称量各组大鼠新鲜右侧肺组织质量记录为湿重，称量后将大鼠肺组织放入60 ℃烘箱中烘烤48 h 后再称量质量记录为干重，计算肺组织W/D比。

3.7 大鼠肺组织中SOD、GSH-Px 活性、MDA 含量、ROS 水平的检测 干重严格按照试剂盒说明书检测大鼠肺组织中 SOD、GSH-Px 活性、MDA 含量。DCFH-DA 荧光探针检测大鼠肺组织中ROS 水平，记录各组的荧光强度值，结果以相对于control 组荧光强度值表示。

3.8 RT-qPCR 检测肺组织中Keap1 和Nrf2 mRNA的表达 使用TRIzol 试剂从肺组织匀浆中分离总RNA。将 RNA 逆转录为 cDNA 后，以 cDNA 为模板进行 RT-qPCR 反应。以 GAPDH 为内参照，通过 2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。GAPDH 的正向引物序列为5′-CATTCTTCCACCTTTGAT-3′，反向引物序列为 5′-CTGTAGCCATATTCATTGT-3′；Keap1 的正向引物序列为 5′-ATCGCTGCTGTCTCTGTA-3′，反向引物序列为 5′-GTTCTGCTGCCTCTTCTG-3′；Nrf2 的正向引物序列为5'-CCAACACACGGTCCACAGCT-3'，反向引物序列为5'-TCCGTCGCTGACTGAAGTCAA-3'。

3.9 Western blot 检测肺组织中 Keap1、Nrf2 蛋白的表达 RIPA 裂解液提取肺组织匀浆总蛋白用于Keap1、GAPDH 蛋白的检测；细胞核蛋白提取试剂盒提 取的肺组织匀浆中的核蛋白用于Nrf2、histone 蛋白的检测。简言之，将蛋白质经定量、电泳、转膜、封闭后，将膜分别与Ⅰ抗 Keap1（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）、Nrf2（1∶2 000）、Histone（1∶1 000）在 4 ℃下过 夜孵育，再在37 ℃下与Ⅱ抗（1∶1 000）共孵育2 h。加入ECL 试剂观察蛋白条带显色情况，经Quantity-One软件量化蛋白灰度值。

4 统计学处理

使用GraphPad Prism 8 进行统计分析，所有数据以平均值±标准差（mean±SD）表示。单因素方差分析用于比较多组之间的差异，进一步两组间的比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AP 对各组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数的影响

与contrl 组比较，model 组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数升高（P＜0.05）；与model 组比较，AP-L 组、AP-H 组和 DEX 组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数降低（P＜0.05）；与AP-L 组比较，AP-H 组和DEX 组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数降低（P＜0.05）；与AP-H组比较，APH+ML385组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数升高（P＜0.05），见表1。

表1 AP 对各组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数的影响Table 1. Effects of AP on the total number of cells and the number of neutrophils in the bronchoalveolar lavage fluid of rats in each group（×105 mL-1. Mean±SD. n=12）

2 AP对各组大鼠血清TNF-α和IL-6水平的影响

与 control 组比较，model 组大鼠血清中 TNF-α 和IL-6 水平升高（P＜0.05）；与model 组比较，AP-L 组、AP-H 组和 DEX 组大鼠血清中 TNF-α 和 IL-6 水平降低（P＜0.05）；与AP-L组比较，AP-H 组和DEX 组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低（P＜0.05）；与AP-H 组比较，AP-H+ML385组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高（P＜0.05），见表2。

表2 AP对各组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平的影响Table 2. The effect of AP on the levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（ng/L. Mean±SD. n=12）

3 AP对各组大鼠肺组织病理损伤的影响

HE 染色结果显示，control 组大鼠肺组织结构正常，肺泡腔清晰可见，肺泡壁薄，未见炎性细胞浸润；model组大鼠肺组织结构异常，肺泡腔出血、渗出，肺泡壁增厚，可见大量炎性细胞浸润；与model组比较，AP-L 组、AP-H 组和DEX 组大鼠肺组织病理损伤减轻，病理评分降低（P＜0.05）；与AP-H 组比较，AP-H+ML385 组大鼠肺组织病理损伤严重，病理评分升高（P＜0.05），见图1。

4 AP对各组大鼠肺组织W/D的影响

与 control 组比较，model 组大鼠肺 W/D 升高（P＜0.05）；与Model组比较，AP-L组、AP-H组和DEX组大鼠肺W/D 降低（P＜0.05）；与AP-L 组比较，AP-H 组和DEX 组大鼠肺W/D 降低（P＜0.05）；与AP-H 组比较，AP-H+ML385组大鼠肺W/D升高（P＜0.05），见图2。

Figure 1. The effect of AP on the lung tissue pathological damage score of rats in each group（HE staining，scale bar=50 μm）. Black arrow：alveolar space；red arrow：alveolar wall. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.图1 AP对各组大鼠肺组织病理损伤评分的影响

Figure 2. The effect of AP on the W/D ratio of rat lung tissues in each group. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.图2 AP对各组大鼠肺组织W/D的影响

5 AP对各组大鼠肺组织中SOD、GSH-Px、MDA和ROS水平的影响

与control 组比较，model组大鼠肺组织中SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量和 ROS 水平升高（P＜0.05）；与model组比较，AP-L组、AP-H组和DEX组大鼠肺组织中SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量和ROS 水平降低（P＜0.05）；与AP-L 组比较，AP-H 组和DEX组大鼠肺组织中SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量和ROS水平降低（P＜0.05）；与AP-H组比较，APH+ML385组大鼠肺组织中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量和ROS水平升高（P＜0.05），见图3。

6 AP 对各组大鼠肺组织中Keap1/Nrf2 通路相关因子mRNA及蛋白表达的影响

与control 组比较，model 组大鼠肺组织Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核 Nrf2 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与model 组比较，AP-L 组、AP-H 组和 DEX 组大鼠肺组织 Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核Nrf2 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与 AP-L 组比较，AP-H 组和 DEX 组大鼠肺组织Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核Nrf2蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与AP-H 组比较，AP-H+ML385 组大鼠肺组织Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核Nrf2蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），见图4。

讨 论

Figure 3. Effects of AP on SOD activity，GSH-Px activity，MDA content and ROS level in lung tissues of rats in each group. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.图3 AP对各组大鼠肺组织中SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量和ROS水平的影响

Figure 4. Comparison of Keap1，HO-1 and Nrf2 mRNA and protein expression levels in lung tissues of rats in each group. A：comparison of Keap1，Nrf2 and HO-1 mRNA expression in lung tissues of rats in each group；B：Western blot was used to detect Keap1，Nrf2 and HO-1 protein expression in rat lung tissues. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.图4 各组大鼠肺组织中Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达的比较

ALI是人类日益关注的问题，并且经常导致具有高发病率和死亡率的急性呼吸窘迫综合征［14］。真菌、病毒和细菌感染是ALI 的主要原因。具体来说，革兰氏阴性菌，如铜绿假单胞菌，会分泌各种内毒素，包括LPS。暴露于LPS会加速中性粒细胞募集和促炎分子的表达，最终加剧ALI的进展［15］。LPS 长期以来被广泛用于诱导ALI 大鼠肺部炎症［16］。本研究通过向气管内注射LPS以构建ALI大鼠模型，结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织病理损伤严重，提示造模成功。中性粒细胞在ALI 的发病机制中起重要作用，去除中性粒细胞可以减少ALI 的损害［17］；肺水肿是ALI 发病机制的中心环节，肺组织的W/D 比可用来评估肺水肿的程度［18］；促炎细胞因子IL-6、TNF- α 在 ALI 的发生发展中起重要调控作用［19］；此外，氧化应激是 LPS 引起 ALI 的主要特征之一，在该过程中肺组织SOD、GSH-Px 活性降低，MDA含量升高［20］；LPS 可通过增加 ROS 的生成引起氧化应激，ROS 的过多积累可引起肺水肿以及大量的炎性细胞浸润，进而导致ALI［8］。本研究显示，与对照组比较，模型组细胞总数、中性粒细胞数、W/D比、IL-6、TNF-α、MDA、ROS含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，提示氧化应激及炎症反应参与了模型大鼠ALI过程，进而造成肺组织病理损伤严重。

AP是苹果中多元酚类化合物的总称，具有抗炎、抗氧化的特性。如AP对LPS诱发的小鼠单核/巨噬细胞 RAW264.7 细胞炎症具有抑制作用［21］；AP 可以提高高脂血症小鼠的抗氧化能力［22］。而关于AP对LPS诱导的大鼠ALI 的影响鲜有报道。本研究显示，低、高剂量AP可抑制ALI大鼠肺组织炎症反应及氧化应激，减轻肺组织病理损伤，且AP 剂量越高，对应的趋势越明显；而AP-H 组与DEX 组比较，对应指标变化差异无统计学意义，提示AP 可能通过抑制炎症反应及氧化应激对LPS诱导的大鼠ALI发挥保护作用。

Keap1/Nrf2信号通路是重要的抗氧化通路，在正常生理状态下，Nrf2 和Keap1 位于细胞质中。然而，当氧化应激被激活时，蛋白激酶将被激活以诱导Nrf2与Keap1解离并转移到细胞核中，入核的Nrf2与抗氧化反应元件（如HO-1）结合，启动抗氧化蛋白的转录，进而发挥抗氧化作用［23］。据报道，百合固金汤通过激活Keap1/Nrf2信号通路对LPS诱导的小鼠ALI发挥保护作用［24］。提示Keap1/Nrf2信号通路的激活可对LPS诱导的ALI 发挥保护作用。本研究结果与其是一致的，本研究显示，模型组大鼠肺组织中Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1蛋白及核Nrf2蛋白表达降低，AP-L组、AP-H组大鼠肺组织中上述指标表达升高，且AP 剂量越高，对应的升高趋势越明显，Model组Keap1表达下调，鉴于Keap1对Nrf2的锚定作用，此时Nrf2应呈现胞质定位减少而入核增多，因此核Nrf2 蛋白量应增加，但本研究Model 组中核Nrf2 含量反而降低，这可能是由于ALI 过程中，机体出现自噬功能障碍，使得p62与Nrf2间的反馈回路无法被破坏，使得Nrf2在胞浆呈持续激活或延长激活状态导致的［25］。基于上述结果推测AP 可能通过激活Keap1/Nrf2信号通路对LPS诱导的大鼠ALI发挥保护作用。为了验证该猜想，本研究在高剂量AP 处理的基础上再加上Nrf2抑制剂ML385干预ALI大鼠，结果显示，ML385减弱了高剂量AP对LPS诱导的大鼠ALI的保护作用，证实了猜想是正确的。

综上所述，AP 可能通过激活Keap1/Nrf2 信号通路对LPS 诱导的大鼠ALI发挥保护作用。AP 可能具有临床治疗LPS诱导的ALI的潜力。