棕榈酸诱导人胰岛β细胞去特征化*

刘 娜， 刘腾丽， 王 乐， 梁 瑞△， 王树森

（1天津市第一中心医院卫生部危重病急救医学重点实验室，天津 300384；2天津市第一中心医院器官移植中心，天津 300190）

糖尿病是一个重大的全球健康问题，其中2 型糖尿病占总发病率的90%［1］。游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）是参与大多数生物体能量代谢的营养物质，研究表明，空腹和餐后的FFA 浓度升高会增加患2 型糖尿病的风险［2］。血浆FFA 浓度的长期增加会导致脂质代谢调节紊乱，从而导致β 细胞功能和活力下降（脂毒性），并因此诱发2型糖尿病［3］。

胰岛功能受损是2 型糖尿病的主要特征之一，其中β 细胞功能下降或质量不足是胰岛功能受损的核心机制。新近的研究表明，β细胞去分化可能是导致2 型糖尿病β 细胞功能受损的主要原因［4-6］。我们已发表的研究中也证实，缺氧及炎症信号通路通过诱导人胰岛β 细胞发生去分化从而导致β 细胞功能障碍［7-8］。因此本研究将主要利用分离得到的中国人群非糖尿病胰岛细胞，探讨棕榈酸（palmitic acid，PA）对人胰岛功能的影响及其机制。

材料和方法

1 材料

人胰腺样本于 2018 年 11 月～2021 年 7 月由天津市第一中心医院器官移植中心提供，该研究经过了天津市第一中心医院伦理委员会的批准（批准号：2018N161KY），样本信息见表1。C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

表1 人胰腺样本信息Table 1. Clinical characteristics of organ donor

2 主要试剂

胰岛消化胶原酶购自Serva；CMRL-1066 培养液购自 Corning；RPMI-1640 培养液、DMEM 培养液和DMEM/F12培养液及胎牛血清和双抗购自Gibco；RIPA蛋白裂解液购自索莱宝；PA购自Sigma；人胰岛素酶联免疫试剂盒和小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒购自Mercodia；豚鼠抗胰岛素抗体（ab7842）购自Abcam；兔抗 NKX6.1 抗体（NBP1-49672）和兔抗 ALDH1A3抗体（NBP2-15339）购自 Novus；兔抗 FOXO1 抗体（LSB-5283）购自LSBio；兔抗MAFA 抗体（CST79737）和兔抗PDX1 抗体（CST5679）购自Cell signaling technology；RNA 逆 转 录 试 剂 盒 购 自 Qiagen；SYBR GREEN购自TaKaRa。

3 实验方法

3.1 PA 配制 利用0.1 mol/L NaOH 溶液配制40 mmol/LPA 溶液，于75 ℃水浴充分皂化约30 min，最终至无色透明澄清。将PBS 溶液预热至55 ℃，配制40%无脂肪酸-BSA 溶液。将40 mmol/LPA 溶液和40%无脂肪酸-BSA 溶液按1∶1 混合，得到20 mmol/LPA存储液。

3.2 人胰岛细胞的制备 人胰岛细胞的制备在天津市第一中心医院GMP 实验室内完成。经主胰管内灌注胶原酶后，应用Ricordi 消化系统将胰腺组织消化，保持37 ℃恒温，利用连续密度梯度离心法获得纯化的人胰岛细胞［9］。双硫腙染色法检测胰岛细胞纯度，FDA/PI染色鉴定胰岛细胞活性，选取纯度超过90%、活性超过90%的胰岛细胞进行本研究。将所提取的胰岛细胞培养于37 ℃、5%CO2的培养箱中。

3.3 小鼠胰岛细胞的制备 小鼠断颈处死后取仰卧位，于近肝门端胆总管逆行插入27G 静脉注射针，灌注（2～4）mL 冷胶原酶P 溶液，迅速将整个胰腺完整地分离放入50 mL 离心管中，于37 ℃水浴锅消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液终止消化，于4 ℃离心机中180×g离心2 min。弃上清后，用RPMI-1640培养液重悬，用40 μm筛网过滤悬液，于4 ℃离心机中180×g 离心2 min。弃上清后加入Histopaque-1077分离液重悬沉淀，之后沿试管壁缓慢加入 RPMI-1640 培养液，于20 ℃离心机中 1036.8×g离心20 min。吸取Histopaque-1077 分离液和RPMI-1640 培养液分界处的胰岛，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液洗2遍后转移至细胞培养皿中，于显微镜下手挑纯化胰岛细胞［10］。将所提取的胰岛细胞培养于37 ℃、5%CO2的培养箱中。

3.4 细胞培养 人胰岛细胞培养于添加了10%胎牛血清和1%双抗的CMRL-1066 培养液中；小鼠胰岛细胞培养于添加了10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640 培养液中；小鼠胰岛素瘤βTC-6 细胞系（ATCC CRL-11506TM）培养于添加了10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养液中；小鼠胰岛素瘤NIT-1 细胞系（ATCC CRL-2055TM）培养于添加了10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/DF12培养液中。

3.5 PA 处理 将人胰岛细胞和小鼠胰岛细胞培养于低黏附6 孔培养板中，每孔200 个胰岛细胞，分为对照组和PA0.6 mmol/L 组；βTC-6 细胞系按每孔106个传于12 孔培养板中，分为对照组和PA0.6 mmol/L组［11］；NIT-1 细胞系按每孔5×105个传于 12 孔培养板中，分为对照组和PA0.2 mmol/L 组，均处理48 h 后，收集细胞，用于后续实验。

3.6 胰岛素分泌水平检测 收集各组胰岛细胞，按所需数量（每个生物学重复7～8 个胰岛细胞）挑选大小接近的胰岛细胞，置于含1.67 mmol/L 葡萄糖的KREB 缓冲液中预孵育1 h，分别依次在含1.67 mmol/L 和 16.7 mmol/L 葡萄糖的 KREB 缓冲液中，于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育1 h，收集上清，利用胰岛素酶联免疫试剂盒检测胰岛素含量［12］。收集胰岛细胞用 RIPA 蛋白裂解液裂解（每孔100 μL），使用Bradford 法测定各孔细胞裂解液中蛋白含量，ELISA试剂盒检测胰岛细胞内胰岛素含量。

3.7 Western blot 收集各组细胞，提取总蛋白。将待测蛋白样品与5×上样缓冲液混合后，煮沸变性5 min，立即冰浴2 min 以上。根据蛋白分子量大小，配制12%的SDS-PAGE，将凝胶置于1× Tris-甘氨酸电泳缓冲液中，取合适量的蛋白样品上样，进行电泳。电泳停止后将凝胶取出，置于转膜专用的三明治夹中，于转移缓冲液中4 ℃、250 mA 恒流转膜。用5%脱脂牛奶封闭膜，并孵育Ⅰ抗。用1×TBST 洗涤后孵育Ⅱ抗，通过增强化学发光法观察免疫反应性条带，利用ImageJ软件进行蛋白定量。

3.8 RT-qPCR 收集各组细胞，提取RNA，依据逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，逆转条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。RT-qPCR 总反应体系为20 μL，包括反转录样本1 μL，上、下游引物各1 μL，无菌水7 μL，Syber Green10 μL。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min（40 个循环）。mRNA 的相对表达量以 36B4 作为内参照，通过 2-ΔΔCT计算。引物序列见表2、3。

表2 人RT-qPCR引物序列Table 2. The suquences of the human primers

3.9 免疫荧光染色 将收集的人胰岛细胞放入4%多聚甲醛中，4 ℃固定30 min，脱水后经石蜡包埋切片（3 μm）。切片脱蜡后，用EDTA 抗原修复液放在微波炉中进行抗原修复。经洗涤、透化、血清封闭后，孵育Ⅰ抗于4 ℃过夜，然后孵育对应的Ⅱ抗，放入37 ℃恒温箱中反应30 min，最后用 DAPI（Vector）进行细胞核染色。采用Pannoramic MIDI 和Pannoramic Viewer（3DHistech）荧光扫描仪器对染色切片进行扫描和图像采集。每个样本至少选择6 个胰岛，利用ImageJ 软件分析目的蛋白表达的荧光强度，并利用IPP 6.0软件分析目的蛋白表达区域面积。

表3 小鼠RT-qPCR引物序列Table 3. The suquences of the mouse primers

4 统计学处理

全部数据采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行分析。组间比较采用非配对t检验，每组数据至少重复3 次，以均数±标准差（mean±SD）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PA 处理导致人和小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌受损

为了研究PA 对β 细胞功能的影响，我们用PA处理人胰岛细胞后，通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验进行检测。结果如图1 所示，高糖（16.7 mmol/L）刺激后，经ELISA 检测胰岛素分泌量，并通过总蛋白量校准后，显示PA 处理的人胰岛细胞组中胰岛素分泌水平降低87%，显著低于对照组（P＜0.05），见图1A；在小鼠胰岛细胞中，我们也观察到相似的结果，PA 处理的小鼠胰岛细胞中，葡萄糖刺激胰岛素分泌降低了80%（P＜0.01），见图1B。

2 PA抑制了β细胞关键转录因子的表达水平

Figure 1. Palmitic acid（PA）impaired the glucose-stimulated insulin secretion. A：absolute insulin secretion from human islets；B：absolute insulin secretion from mouse islets. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图1 棕榈酸处理使葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损

为了探究PA 导致β 细胞胰岛素分泌受损的机制，我们首先通过Western blot 检测了小鼠β 细胞系βTC-6 和 NIT-1 中 β 细胞关键转录因子 Pdx1 和 MafA的蛋白表达水平，结果显示PA 处理组较对照组Pdx1和MafA 的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图2A、B。RT-qPCR 结果显示，PA 处理组较对照组βTC-6、NIT-1 和小鼠胰岛中β 细胞关键转录因子Pdx1、Nkx6.1 和MafA 的 mRNA 表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），见图2C～E。且3例非糖尿患者胰岛细胞经PA 处理后，结果亦显示PA 处理组较对照组显著抑制了人胰岛β 细胞关键转录因子PDX1、NKX6.1 和 MAFA 的 mRNA 表达水平（P＜0.05 或P＜0.01），见图2F～H。

3 PA 对人胰岛 β 细胞中 NKX6.1 和 FOXO1 表达分布的影响

我们进一步通过免疫荧光染色实验检测了PA处理后的人胰岛β 细胞中NKX6.1 和FOXO1 的表达水平及分布情况。结果如图3 所示，NKX6.1 主要在人胰岛β细胞的细胞核中表达，相较于对照组，PA处理组人胰岛β 细胞表达NKX6.1 的平均荧光强度显著下调，NKX6.1 表达面积亦显著下调（P＜0.05）。PA 处理组中，未观察到NKX6.1 由人胰岛β 细胞的细胞核转移到细胞质，29%的insulin 阳性细胞中NKX6.1表达丢失（见图3A白色箭头）。FOXO1则主要在人胰岛β 细胞的细胞质中表达，相较于对照组，PA 处理组人胰岛β 细胞表达FOXO1 的平均荧光强度下调，FOXO1 表达面积亦显著下调（P＜0.01），但未观察到FOXO1 由细胞质向细胞核转位的现象，见图4。

4 PA对人胰岛β细胞中ALDH1A3表达的影响

β细胞去分化的关键特征是回到祖细胞样阶段，ALDH1A3 作为祖细胞的标志性分子，通常在去分化的细胞中富集表达。3 例非糖尿患者胰岛细胞的RT-qPCR 结果均显示，PA 显著抑制了人胰岛 β 细胞中ALDH1A3的 mRNA 表达水平（P＜0.01），见图 5。我们通过免疫荧光染色实验检测了PA 处理后人胰岛 β 细胞中 ALDH1A3 表达，结果显示，ALDH1A3 阳性的细胞均不表达insulin，与对照组相比，PA处理组人胰岛β 细胞表达ALDH1A3 的平均荧光强度无显著差异，ALDH1A3 表达面积亦无显著差异（P＞0.05），见图6。

5 PA诱导人胰岛细胞炎症反应

通过RT-qPCR 实验检测PA 处理后人胰岛细胞中炎症因子的表达水平，结果显示PA 显著上调了人胰岛细胞中 IL-1β 和 COX2 的 mRNA 表达水平（P＜0.01），见图7。

讨 论

PA 是人体中最普遍的饱和脂肪酸，流行病学研究显示PA 和2 型糖尿病密切相关，且在个体饱和脂肪酸中，PA 对糖尿病的发展具有更高的风险比［13］。因此，我们通过分离非糖尿患者胰岛细胞和小鼠胰岛细胞，体外暴露于PA 培养48 h，PA 显著抑制高糖刺激的人胰岛细胞和小鼠胰岛细胞胰岛素分泌，导致β细胞功能受损。

多项机制研究表明脂肪酸主要通过激发内质网应激［14-16］，诱导氧化应激反应和线粒体功能障碍［17-18］，诱导 β 细胞自噬［19-21］，激活 β 细胞炎症通路［22-23］，进而导致β 细胞功能衰竭。我们的研究显示，PA 处理抑制了β 细胞系中关键转录因子Pdx1 和MafA的蛋白表达水平，且抑制了β细胞系，小鼠及人胰岛细胞中β 细胞关键转录因子包括Pdx1、Nkx6.1和MafA 的mRNA 表达水平。免疫荧光染色实验进一步证实了PA 处理引起非糖尿患者胰岛β 细胞中NKX6.1 和FOXO1 蛋白水平表达降低。研究报道显示2 型糖尿病β 细胞去分化程度随着病程的发展而推移，表现为FOXO1 由细胞质转位至细胞核至表达丢失，NKX6.1 由细胞核转位至细胞质［5］，我们已发表的研究也报导了中国2 型糖尿患者胰岛β 细胞中NKX6.1 的异常表达，包括NKX6.1 在细胞核质中均表达，NKX6.1 仅在细胞质中表达以及β 细胞NKX6.1 表 达 缺 失［24］。 本 研 究 中 PA 处 理 前 后NKX6.1均在人胰岛β细胞细胞核中表达，FOXO1均在人胰岛β 细胞细胞质中表达，暂未观察到NKX6.1和FOXO1 的细胞转位，但29%的insulin 阳性细胞NKX6.1 表达缺失。成熟β 细胞的身份特征由β 细胞核心转录因子和胰岛素决定［25］，因此，我们认为PA诱导非糖尿患者胰岛β细胞发生了去特征化。

Figure 2. Palmitic acid（PA）inhibited the expression of β-cell key transcription factors. A and B：effect of PA treatment on the protein expression of Pdx1 and MafA in βTC-6 cells and NIT-1 cells；C～H：relative mRNA expression in βTC-6 cells，NIT-1 cells，mouse islets and human islets with or without PA for 48 h. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图2 棕榈酸抑制β细胞关键转录因子的表达水平

Figure 3. Immunofluorescence staining of NKX6.1 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. A：PA inhibited NKX6.1 expression in human islet β cells［immunofluorescence staining of NKX6.1（red），insulin（Ins，green）and DAPI（blue）in human islets with or without PA treatment；arrows indicated the β cells without NKX6.1 expression；scale bar=20 μm］；B，C and D：quantification of NKX6.1 expression and β cells with nuclear expression of NKX6.1（NKX6.1nuc+Ins+cells）. Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图3 棕榈酸对人胰岛β细胞中NKX6.1表达分布的影响

ALDH1A3是成熟 β 细胞非允许基因，其在 β 细胞中的异位表达是β 细胞去分化特征之一［26］。为了研究PA 处理是否通过诱导β 细胞去分化，从而使β细胞功能受损，我们检测了ALDH1A3 在人胰岛β 细胞中的表达情况。结果显示PA 处理后，但并未导致ALDH1A3 表达的升高，即未发生向祖细胞方向的去分化。Nordmann 等［27］用硬质酸盐处理小鼠胰岛细胞，同样是仅仅观察到β 细胞特有的转录因子和功能基因的变化，但并未观察到ALDH1A3 的变化，即未发生去分化，这与我们的研究结果一致。

我们已发表的研究证实了中国2 型糖尿患者群胰岛β 细胞中炎症水平上调，且IL-1β/COX2/PGE2信号通路在 β 细胞功能损伤中发挥重要作用［12，28］。我们的研究发现PA 促进了胰岛细胞中IL-1β 和COX2 mRNA 表达水平的上调，推测PA 可能通过诱导胰岛内炎症水平升高，从而导致β 细胞功能损伤。以往的研究中也已经证实了炎症信号在诱导β 细胞去分化中发挥重要作用［27］。然而，尽管脂肪酸急性处理增强了胰岛内的炎症信号，但是仅仅导致β 细胞功能方面的“去特征化”，并未导致ALDH1A3表达的升高，发生向祖细胞方向的转化。可见脂肪酸对β细胞的毒性作用机制较为复杂，所引起的炎症水平升高只是其中的一部分改变，可能并非主导的信号通路。

Figure 4. Immunofluorescence staining of FOXO1 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. A：PA inhibited FOXO1 expression in human islet β cells［immunofluorescence staining of FOXO1（red），insulin（Ins，green）and DAPI（blue）in human islets with or without PA treatment；scale bar=20 μm］；B and C：quantification of FOXO1 expression.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group.图4 棕榈酸对人胰岛β细胞中FOXO1表达分布的影响

Figure 5. Relative mRNA expression of ALDH1A3 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.图5 棕榈酸处理对人胰岛β细胞中ALDH1A3 mRNA表达水平的影响

Figure 6. Immunofluorescence staining of ALDH1A3 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. A：PA treatment had no effect on ALDH1A3 expression in human islets［immunofluorescence staining of ALDH1A3（red），insulin（Ins，green）and DAPI（blue）in human islets with or without PA treatment；scale bar=20 μm］；B and C：quantification of ALDH1A3 expression. Mean±SD. n=10.图6 棕榈酸对人胰岛β细胞中ALDH1A3表达的影响

Figure 7. Relative mRNA expression of IL-1β and COX2 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.图7 棕榈酸对人胰岛细胞中IL-1β 和COX2 mRNA 表达水平的影响

综上所述，本研究检测PA 暴露对体外分离的原代人胰岛细胞造成的损伤。首先，我们观察到PA 处理严重损伤了胰岛细胞的葡萄糖刺激下胰岛素分泌能力；其次，进一步的分子生物学研究显示，PA 处理抑制 β 细胞关键转录因子 PDX1、NKX6.1、MAFA 和FOXO1 等的表达，但是并未造成β 细胞去分化标志基因ALDH1A3表达的升高，及 FOXO1 和 NKX6.1 的错误转位，提示PA 处理可能诱导了β 细胞发生去特征化，进而引起β 细胞功能障碍；第三，对炎症信号通路的研究显示，PA 处理激活了胰岛内IL-1β/COX2信号通路，提示PA 引起的炎症反应可能也参与调控了β细胞的去特征化。