Sap30调节小鼠造血干细胞的损伤恢复和体外扩增*

詹 蔷， 黄璐圆， 张锦华， 刘 进， 鞠振宇， 陈陟阳△

（1暨南大学教育部再生医学重点实验室，衰老与再生医学研究院，广东 广州 510632；2广州实验室，广东 广州 510005；3暨南大学附属第一医院心内科，广东 广州 510630）

在生理条件下，造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）在自我更新和多能分化之间保持平衡［1］，确保血液系统中成熟细胞的数量稳定且保证HSC池不会耗尽。作为造血系统中最上游的细胞，HSCs在骨髓中占比很小，但在许多造血相关疾病的治疗中发挥着不可替代的作用［2］。HSCs移植是临床治疗血液学及免疫相关疾病最有效的方法，然而HSCs来源的稀缺性极大限制了其临床应用，如何有效解决HSCs体外扩增是领域内亟待解决的问题［3］。化疗是广泛应用于多种肿瘤治疗的重要手段，然而化疗极大地影响了患者HSCs的功能，进而抑制了化疗患者的自身免疫力。若能有效促进化疗后HSCs数目的恢复，将提高化疗患者的免疫力并促进血液系统的重建。虽然有许多研究从多种角度探究如何实现HSCs的有效功能性扩增［4-7］，但其具体机制仍不明确。

组蛋白乙酰化作为蛋白质翻译后修饰的重要调控机制，在调控HSCs的功能中起到重要作用［8］。组蛋白乙酰化修饰主要通过乙酰转移酶和脱乙酰酶的协同作用，调节乙酰基在赖氨酸上的转移进而调节染色质结构和动态，从而上调基因转录［9］；相反，组蛋白脱乙酰酶通过去除乙酰赖氨酸残基上的乙酰化标记而抑制基因表达。Sap30作为Sin3A和NCoR共抑制因子复合物的配体，可以招募组蛋白脱乙酰酶实现组蛋白去乙酰化。有报道显示，Sap30基因的缺失通过调控染色质可及性的改变抑制了成体细胞基因的表达，进而促进了成纤维细胞重编程为多潜能干细胞［10］。然而，Sap30介导的乙酰化修饰在HSCs损伤恢复及体外扩增中的作用尚未见报道。本研究应用Sap30基因缺失（Sap30-/-）小鼠模型，开展针对Sap30在小鼠HSCs中功能的研究，以动物模型开展的体内、外实验数据为基础，为以后HSCs的应用提供参考资料。

材料和方法

1 动物

Sap30-/-及野生型（Sap30+/+）对照小鼠（均为白细胞表面抗原CD45.2阳性小鼠）由中国科学院广州生物与健康研究院提供，经由广东省实验动物检测所净化，生产许可证号为SCXK（粤）2018-0044，净化后引进并饲养繁殖于暨南大学实验动物中心屏障环境动物房［SYXK（粤）2017-0174］，雌雄及数量不限，2～20月龄。HSCs竞争性移植的供体：CD45.2+小鼠；竞争者：CD45.1+小鼠；受体：CD45.1+CD45.2+双阳性小鼠饲养于暨南大学实验动物中心屏障环境动物房［SYXK（粤）2017-0174］，各亚型之间没有功能性的区别。本实验已获得暨南大学动物实验中心伦理委员会批准，并严格按照动物使用原则执行。

2 主要仪器和试剂

LSRFortessa流式细胞分析仪和FACSAria III流式细胞分选仪（BD）；RS 2000 Pro生物辐射系统（Rad Source）；XN-1000V（B1）全自动五分类动物血液分析仪（Sysmex）；5% Baytril购 自Bayer；Biotin-CD4（100508） 、Biotin-CD8（100704） 、Biotin-B220（103204）、Biotin-CD11b（101204）、Biotin-Ter-119（116204） 、PerCP-Cy5.5-IL-7R（135022） 、PECD45.2（109808）、PE-CD150（115927）、PE-Cy7-Sca-1（122514）、APC-Cy7-SA（405208）、FITC-CD4（100510）、FITC-CD8（100706）、APC-B220（103212）和FITC-CD48（103443）购自Invitrogen；PE-Flt3（12-1351-83）、APC-c-Kit（17-1171-83）、AF700-CD16/32（56-0161-82）和PerCP-Cy5.5-CD45.1（45-0453-82）购自Thermo Fisher；红细胞裂解液（555899）和FITCCD34（553733）购自BD Pharmingen；penicillin/streptomycin购自Invitrogen；DAPI（D9542-10MG）购自Sigma；TPO（78072.1）、SCF（78064.1）和SFEM（serumfree expansion medium；09655）购 自STEMCELL Technologies；70 μm滤 膜（22363548）购 自Fisherbrand；异氟烷（R510-22-2）购自RWD；Anti-APC Microbeads（130-090-855）和LS Separation Columns（130-042-401）购自Miltenyi。

3 方法

3.1 流式细胞术分析骨髓中造血干/祖细胞 以野生型小鼠作为对照组，Sap30基因敲除小鼠作为实验组，每组5～8 只小鼠。对野生型和基因敲除小鼠采取颈椎脱臼牺牲［11］，取出股骨、胫骨、髂骨及脊柱后，放入研钵中用10 mL 缓冲液（1× PBS+2%胎牛血清FBS）研磨挤压出骨髓细胞，经过200 目滤膜过滤后取10 μL 细胞悬液计数。将细胞悬液300×g离心5 min 后重悬至细胞浓度为1×1011/L，从中取出100 μL细胞悬液加入 10 μL Lin+抗体混合物［CD4、CD8、B220、Ter119、CD11b 和Gr1 与生物素（biotin）偶联的抗体］，在冰上避光孵育30 min；缓冲液洗去抗体后再次300×g离心5 min，弃上清后每个样本加入30 μL 含其他表面标记抗体的混合物（表1）重悬［12］，在冰上避光孵育30 min；缓冲液洗去抗体后再次300×g离心5 min，弃上清后每个样本加入500 μL缓冲液重悬细胞并转移至流式管中，使用LSRFortessa 流式细胞仪收集样本，收集前加入DAPI（1 g/L），使用Flow-Jo 10对流式细胞仪记录的数据进行处理。

表1 造血干/祖细胞流式分析染色方案Table 1. Antibody combination for flow cytometric staining of hematopoietic stem/progenitor cells

3.2 流式细胞术分析小鼠脾脏、胸腺和外周血中各类成熟细胞 以野生型小鼠作为对照组，Sap30基因敲除小鼠作为实验组，每组5～8 只小鼠。对野生型和基因敲除小鼠进行深度麻醉后取外周血并采取颈椎脱臼牺牲，取出脾脏和胸腺后，经过200 目滤膜过滤后用5 mL 缓冲液（1×PBS+2%胎牛血清FBS）研磨成细胞悬液并计数，将细胞悬液300×g离心5 min 后重悬至细胞浓度为1×1011/L，从中取出20 μL 细胞悬液加入表面标记抗体混合物（表2），在冰上避光孵育30 min；缓冲液洗去抗体后再次300×g离心5 min，弃上清后每个样本加入200 μL缓冲液重悬细胞并转移至流式管中，使用LSRFortessa 流式细胞仪收集样本，收集前加入DAPI（1 g/L），使用FlowJo 10 对流式细胞仪记录的数据进行处理。

表2 B细胞、T细胞和髓系细胞的流式分析染色方案Table 2. Antibody combination for flow cytometric staining of B/myeloid/T cells

3.3 小鼠造血干/祖细胞流式分选 以野生型小鼠作为对照组，Sap30基因敲除小鼠作为实验组，每组3～5 只小鼠。参考3.1 方法制备骨髓细胞悬液后，按照干细胞富集试剂盒步骤进行c-kit+富集后再进行表面抗体标记染色（参考3.1 抗体染色步骤），使用FACSAria III 流式分选仪分选造血干/祖细胞于染色缓冲液中。

3.4 HSCs 竞争性移植模型建立及移植小鼠嵌合率分析 以野生型小鼠作为供体对照组，Sap30基因敲除小鼠作为供体实验组，每组5～8 只小鼠（表面抗原CD45.2+）。参考3.3 造血干/祖细胞流式分选步骤，分选出野生型及Sap30基因缺失的供体小鼠LSK 细胞；同时制备竞争者小鼠（表面抗原CD45.1+）的骨髓单细胞悬液，将 1 000 个供体 LSK 与 1×106个竞争者小鼠骨髓细胞混合（200 μL/受体），一同经尾静脉移植到经过致死剂量（8 Gy，X-ray）照射的受体小鼠（表面抗原CD45.1/2 双阳性，辐照后残留＜5%）中，移植之后对受体小鼠进行一个月抗生素（含1%拜有利的饮用水）处理［13-14］。移植后每4 周对小鼠采取麻醉后眼眶后静脉取外周血后进行表面抗体染色（表3），使用LSRFortessa流式细胞仪收集样本统计嵌合率。

表3 造血干细胞移植受体小鼠外周血流式分析染色方案Table 3. Antibody combination for flow cytometric staining of peripheral blood cells

3.5 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）处理模型建立及分析 以野生型小鼠作为对照组，Sap30基因敲除小鼠作为实验组，每组4～5 只小鼠。对野生型和Sap30基因敲除小鼠分别注射 5-FU（150 mg/kg）［15］，并在6 d 和12 d 后牺牲小鼠并取出骨髓使用流式细胞仪进行分析，统计各组小鼠造血干/组细胞在全骨髓细胞中所占比例及绝对数。

3.6 HSCs 体外培养及分析 参考3.3 分选出野生型和基因敲除小鼠的造血干/祖细胞进行体外培养［16］，每孔种入 10 000 个细胞，使用 48 孔细胞培养板培养，培养条件为SFEM 培养液+50 μg/L TPO+50 μg/L SCF+1% penicillin/streptomycin，5% CO2，37 ℃培养箱培养6、7 d 后，收集细胞进行表面抗体染色，并使用流式细胞仪分析。

4 统计学处理

实验数据均采用均值±标准差表示（mean±SD），并利用GraphPad Prism 软件进行后续的统计分析。数据在满足正态分布并通过方差齐性检验的条件下，两组间比较采用Student'st检验进行显著性分析，当P＜0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

1 Sap30在髓系细胞中高表达

应用Sap30基因报告小鼠（图1A），使用流式细胞术检测各类血细胞中mCherry+细胞比例（图1B）。骨髓分析结果显示，Sap30基因在造血干/祖细胞中高表达，随着下游向淋系发育表达逐渐降低（图1C）。mCherry+细胞在外周血、骨髓、脾脏和胸腺中的髓系细胞（CD11b+细胞）中的占比显著高于淋系细胞（B、T细胞；P＜0.05；图1D～G）。

2 Sap30基因缺失不影响稳态造血

与野生型小鼠相比，Sap30-/-小鼠骨髓、外周血、胸腺和脾脏中B 细胞、T细胞和髓系细胞的比例无显著差异（P＞0.05；图2A～D）。流式细胞术结果显示，稳态下与野生型小鼠相比，Sap30-/-小鼠骨髓中HSCs（CD34+CD150+LSK）、共同淋系祖细胞（common lymphoid progenitors，CLPs）和共同髓系祖细胞（common myeloid progenitors，CMPs）的百分比无显著差异（P＞0.05；图2E～G）。HSCs 单克隆集落形成实验结果显示，与野生型相比，Sap30基因缺失的HSCs集落的大小没有显著差异（P＞0.05；图2H）。移植后分别在第1、2 和3 个月检测受体小鼠外周血中供体LSK 来源的血细胞比例，结果显示与野生型相比，Sap30基因缺失的LSK 对受体小鼠外周血重建能力无显著差异（P＞0.05；图 2I～J）。HSC 移植后的归巢检测显示，与野生型相比，Sap30基因的缺失并不影响HSC的归巢（P＞0.05；图2K）。

3 Sap30 基因缺失促进5-FU 处理后造血干/祖细胞再生

通过对Sap30-/-组和对照组小鼠进行腹腔5-FU（150 mg/kg）注射，建立5-FU 诱导的化疗模型。在5-FU 注射后第6 天和第12 天牺牲小鼠，分析骨髓中造血干/祖细胞的数目（图3A），分析结果显示，Sap30基因缺失可显著增加5-FU 处理后HSC 和MPP 的恢复（P＜0.05；图3B～3D）。本实验所使用的基因缺失小鼠为全身敲除模型，为了排除其它组织器官中Sap30缺失对骨髓HSC 的影响，我们通过全骨髓移植构建了嵌合小鼠模型（骨髓为WT 或者KO，环境均为WT），对嵌合小鼠进行5-FU 处理（图3E）。结果显示，Sap30缺失仍可以增加骨髓中造血干/祖细胞的数目和在全骨髓细胞中所占比例（P＜0.05；图3F～3G），也可以显著增加血液中白细胞的数量（P＜0.05；图3H），促进5-FU处理后血液体统重建。

4 Sap30基因缺失增强HSC体外扩增能力

构建体外再生模型，分别对野生型和Sap30-/-小鼠骨髓中分选出来的HSC（图4A）进行了体外培养。体外培养7 d 后分析结果显示，Sap30基因缺失促进HSC数目维持（P＜0.05；图4B）。

讨 论

化疗作为目前杀伤恶性肿瘤细胞的重要手段，在杀伤肿瘤细胞的同时也会抑制正常HSCs 的功能，在进行化疗后HSC需要迅速向下游分化来恢复造血系统的稳态。在这一过程中如改善HSCs 的功能使造血系统尽快恢复重建，对于化疗后病人健康状态的恢复及免疫水平的提高存在重要的临床意义［17］。改善小鼠HSCs 功能的手段众多，如运动［18］和卡路里限制［19］等都能有效改善小鼠HSCs 的功能。在本研究中，我们应用基因缺失小鼠模型，以5-FU 模拟临床的化疗手段，开展了针对小鼠HSC 损伤后修复的研究。我们的研究显示，Sap30基因的缺失在5-FU处理模拟的化疗模型中能够显著提高HSCs 的再生能力，为提高化疗后造血系统功能的恢复提供了干预靶点。HSCs 移植对众多疾病的治疗具有广泛的应用价值，然而HSCs 有限的细胞来源及不成熟的体扩增/外再生的手段，极大地限制了供体来源的HSCs的数目［20］。近年来，越来越多的研究从组蛋白乙酰化修饰的角度开展了对HSC 体外扩增/再生的表观遗传调控机制研究，并证明许多脱乙酰酶抑制剂可以有效地促进HSCs 的体外扩增/再生。本研究中，应用小鼠模型及小鼠HSCs 体外培养实验，结果显示提示抑制脱乙酰酶辅酶的活性同样能够有效的促进HSC的体外扩增的作用。

Figure 1. Sap30 was highly expressed in myeloid cells. A：strategies for constructing a Sap30-/- mouse model；B：FACS analysis showing the expression of Sap30 gene in peripheral blood（PB）；C：the percentages of mCherry+ cells in stem/progenitor cells；D to F：the percentages of mCherry+ cells in B cells，T cells and myeloid cells in PB（D），bone marrow（E）and spleen（F）；G：the percentages of mCherry+ cells in different T cells in thymus. Mean±SD. n=5 to 8.**P＜0.01 vs myeloid cells；△△P＜0.01 vs CD4-CD8-group.图1 Sap30在髓系细胞中高表达

Figure 2. Sap30 was dispensable for maintaining hematopoiesis at steady stage. A to C：the percentages of B cells，T cells and myeloid cells in bone marrow（BM），peripheral blood（PB）and spleen of wild-type and Sap30 gene deletion mice；D：the percentages of different T cells in thymus of wild-type and Sap30 gene deletion mice；E to G：the proportions of hematopoietic stem cells（HSCs；E），common lymphoid progenitor（CLP；F）and common myeloid progenitor（CMP；G）in BM of wild-type and Sap30 gene deletion mice（n=5 to 8）；H：the single HSC was sorted，and the size of colonies were measured（n=3 to 5）；I：the experimental scheme of LSKs transplantation assay；J：the chimerism of PB of recipient mice was analyzed at 1，2 and 3 months after the transplantation（n=3 to 5）；K：the percentages of CFSE-dilution on BM and spleen（n=3 to 5）.图2 Sap30基因缺失对小鼠造血系统的影响

Figure 3. Sap30 deletion improved hematopoietic stem/progenitor cell regeneration in response to 5-FU treatment. A：the experimental scheme of 5-FU induction chemotherapy model；B and C：the percentages（B）and absolute numbers（C）of HSC and MPP in BM；C：of HSC and MPP after 5-FU injection on day 6；D：the percentages of HSC and MPP in BM after 5-FU injection on day 12；E：the experimental scheme of BM competitive transplantation assay；F and G：the percentages（F）and numbers（G）of LSK after 5-FU injection on day 6；H：the number of WBC. Mean±SD. n=3 to 4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sap30+/+group.图3 Sap30基因缺失促进了造血干/组细胞在5-FU处理后的再生

Figure 4. Sap30 deletion enhanced hematopoietic stem cell（HSC）ex vivo expansion. A：the experimental scheme of HSC ex vivo culture；B：the number of LSK was checked by FACS after 7 d. Mean±SD. n=4 to 5.*P＜0.05 vs Sap30+/+group.图4 Sap30基因缺失促进了造血干细胞的体外扩增

Sap30 蛋白作为脱乙酰酶的辅酶，调控组蛋白H3K27 乙酰化位点［11］，我们观察到它在髓系细胞中特异性表达，或可作为造血系统的细胞向髓系分化的表面标记，但其生理意义并不明确。同时我们观察到稳态造血条件下Sap30的缺失并不会影响骨髓中各类细胞的比例，然而在应激或再生模型中Sap30的缺失增强了HSCs 的功能并促进其造血重建能力，提示Sap30在血液系统中的功能是条件依赖性的，应激环境可能激活了某类转录因子的表达从而招募乙酰化蛋白使得染色质中的某些特定区域发生乙酰化从而由关闭状态到开放状态进而调控HSC 的功能。由于Sap30调控H3K27 乙酰化位点，进一步明确Sap30在再生模型下的作用机制需要结合转录组学测序和H3K27乙酰化的ChIP-Seq来分析。