盘基网柄菌HtrA2基因的克隆与生物信息学分析

陈苏维，艾雪言，刘 晔，叶文燕，马雯慧

（安康学院 现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000）

HtrA2（Omi）基因位于人类染色体2p13.1，转录可生成2.1 kb和4.5 kb不同mRNA，但以前者为主[1]。HtrA2蛋白由458个氨基酸组成，含8个外显子，在大部分的正常组织器官中都能表达[2-3]。Strauss等[4]对德国414例帕金森病（Parkinson’s disease，PD）患者和331名健康人的HtrA2基因进行测序发现，PD患者存在A141S（G421T）和G399S（G1195A）突变，这两种突变体在多巴胺能细胞中过表达能够诱发线粒体膜功能障碍和明显蛋白酶失活，从而使细胞对应激反应更加敏感，因而导致细胞死亡。Kawamoto等[5]在PD患者大脑路易小体中也发现了HtrA2蛋白。其他学者的研究进一步证实了HtrA2基因在PD中的易感性以及与PD的相关性[6-7]。

HtrA2蛋白细胞外过表达可诱导细胞发生凋亡作用[8]。作为一种促细胞凋亡因子，HtrA2被发现在细胞和心肌衰老、急性肺炎和白血病发生等方面也发挥重要作用[9-12]。研究还发现，成熟HtrA2蛋白具有酶活性和分子伴侣功能，能够降解细胞内错误折叠的蛋白质，在细胞发生应激反应时通过诱导caspase依赖性或caspase非依赖性细胞凋亡发挥其细胞保护作用[13-14]。

盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）隶属原生生物界变形虫门（Amoeba）黏菌纲（Mycetozoa）[15]，属于单细胞真核生物，是研究细胞信号转导、细胞发育和形态发生、神经退行性疾病机制的模式生物[16-18]。盘基网柄菌在营养丰富时以二分裂方式繁殖后代；缺乏营养时，单细胞则经历细胞聚集、细胞丘、蛞蝓体和子实体4个阶段形成多细胞[19]。盘基网柄菌单倍体基因组编码约12 500种蛋白质，其中许多种蛋白质与哺乳动物直系同源，33种蛋白质与人类某些疾病相关蛋白质直系同源[20]，因而盘基网柄菌被作为模式生物广泛用于人类肿瘤、帕金森病和白血病等相关研究。

本研究通过同源序列分析，得到人类HtrA2的盘基网柄菌同源基因，对其进行了PCR克隆和生物信息学分析，以期为今后构建盘基网柄菌HtrA2重组真核表达载体、获得相应转化株、进行基因型和表现型相应性分析、构建HtrA2相关型疾病的盘基网柄菌模型等奠定基础。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料

实验所用质粒载体为pUC18，实验菌株为大肠杆菌DH5α和盘基网柄菌AX2。

1.2 研究方法

1.2.1 盘基网柄菌总基因组DNA提取

从生长克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）的标准培养基上收集约107个盘基网柄菌细胞，2500 r/min室温离心30 s，将收集的细胞用盐溶液冲洗4次去除残留的克雷伯氏菌，用1 ml DNAzol 4℃放置30 min对细胞进行裂解。裂解液室温12200 r/min离心10 min，然后取上清液用0.5 ml 100%酒精进行沉淀，8600 r/min离心5 min。将沉淀所得盘基网柄菌总基因组DNA用1 ml 70%酒精洗涤3次后悬浮于100 μl 8 mM氢氧化钠溶液4℃贮存或立即使用。

1.2.2 PCR扩增盘基网柄菌HtrA2基因

参照Dictybase公布的基因序列，运用Primer 5.0软件设计HtrA2特异性引物（见表1），并由生工生物（上海）股份有限公司进行合成。

表1 扩增盘基网柄菌HtrA2基因的上、下游引物序列

以提取的盘基网柄菌基因组DNA为模板，扩增HtrA2基因全长序列，100 μl PCR反应物体系包括：盘基网柄菌总基因组DNA 2 μl，双蒸水78 μl，PCR 缓冲液 （10 x） 10 μl，Mgcl2 （50 mM） 5 μl，dNTP（10 mM）混合物2 μl，上、下游引物（10μM）各1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl。PCR扩增反应条件和参数为：（1）95℃模板变性5 min；（2）95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min为1次，共循环35次；（3）72℃延伸10 min。

1.2.3HtrA2基因和pUC18质粒的限制性酶切和连接

利用限制性内切酶EcoR I对扩增的盘基网柄菌HtrA2基因和pUC18质粒进行酶切，10 μl酶切反应体系为：PCR缓冲液（10 x）1 μl，HtrA2或pUC18 质粒 （0.2～1 μg/μl） 2 μl，EcoRI 1μl，双蒸水6 μl。将该反应体系37℃温育1.5 h，然后加入硼酸钠电泳显示剂（SBE）使之失活。酶切结果经电泳检测后，利用PureLinkTMQuick Gel Extraction Kit对HtrA2和pUC18进行抽提和纯化。用15 U热敏碱性磷酸酶（TSAP）37℃处理1 μg pUC18质粒DNA 30 min以去除质粒5'端磷酸，再通过微量渗析去除多余电解液以避免质粒自身重新环化。最后HtrA2和质粒pUC18以7∶1的比例按下述反应体系进行连接：HtrA2基因 22 μl，T4 连接酶 2 μl，T4连接缓冲液（10x）3 μl，pUC18质粒3 μl，16 ℃过夜进行连接反应，所形成产物为pUC18-HtrA2重组载体。

1.2.4 大肠杆菌转化株的获取和筛选

利用电穿孔法将制备的重组载体pUC18-HtrA2转入电感受态E.coliDH5α细胞。对所制备的细胞液进行不同浓度稀释，然后接种到含100 μg/ml阿莫西林的LB培养基上，37℃过夜培养，再利用蓝-白斑法对转化株进行筛选。

1.2.5 大肠杆菌重组载体的提取、纯化及测序

利用碱裂解法将所筛选转化株中的重组载体pUC18-HtrA2进行抽提，经限制性内切酶酶切和凝胶电泳检测后，参考PureLinkTMHiPure Plasmid Filter Purification Kit和PureLinkTMHiPure Precipita‐tor Module的使用方法进行大规模重组表达载体的提取和纯化。

盘基网柄菌HtrA2基因的测序由生工生物（上海）股份有限公司完成。

1.2.6 盘基网柄菌HtrA2基因的生物信息学分析

利用人类帕金森病相关HtrA2基因的氨基酸序列在 NCBI（National Center for Biotechnnology In‐formation）网站进行BLAST比对分析，查询对应的盘基网柄菌同源HtrA2基因并构建盘基网柄菌HtrA2系统进化树；利用Protparam软件分析盘基网柄菌HtrA2蛋白的理化性质；利用TMHMM和Sig‐nalP 5.0 Server软件分别预测HtrA2蛋白的跨膜结构和信号肽；利用SMART软件预测HtrA2蛋白的结构域；利用SOPMA和SWISS-MODEL软件分别预测HtrA2蛋白的二级和三级结构。

2 结果与分析

2.1 人类HtrA2基因的盘基网柄菌同源基因

为了用盘基网柄菌作为模式生物研究人类帕金森病相关HtrA2基因的功能，利用人类HtrA2蛋白的编码氨基酸在Dictybase上查询盘基网柄菌同源HtrA2蛋白。查询结果表明，其同源蛋白完全相同的氨基酸序列占28%，极为相似的占46%，而两者之间的差异占8%（见图1）。

图1 人类HtrA2基因和盘基网柄菌HtrA2蛋白氨基酸序列的BLAST对比

2.2 盘基网柄菌HtrA2基因的PCR克隆结果

利用提取的盘基网柄菌总基因组DNA作为模板，扩增HtrA2基因全长序列，凝胶电泳结果发现HtrA2基因全长约2 000 bp（见图2）。

图2 HtrA2基因的PCR克隆结果

2.3 盘基网柄菌HtrA2基因重组载体的酶切及测序

将PCR扩增产生的盘基网柄菌HtrA2基因通过酶切插入大肠杆菌质粒pUC18，获得重组载体pUC18-HtrA2。双酶切鉴定发现：pUC18-HtrA2中插入的HtrA2基因大小和方向均正确（见图3）。

图3 pUC18-HtrA2双酶切鉴定结果

测序结果表明，盘基网柄菌HtrA2基因大小为2 023 bp，含1个内含子（496～574 bp）。

2.4 盘基网柄菌HtrA2基因的核苷酸同源序列比对

将测序所得的盘基网柄菌HtrA2基因序列在NCBI网站中进行BLAST对比，结果见下页图4。图4显示，本研究所用盘基网柄菌AX2菌株的HtrA2核苷酸序列与其同种AX4菌株的完全相同，与其同属不同种D.purpureum和D.fasciculatum的相似度分别为82.48%和75.97%，与其不同种属Weissella的相似度为95.12%，而与蓝细菌属3种不同菌株的相似度都为88.68%。

图4 盘基网柄菌HtrA2基因核苷酸序列与参考菌株同源序列比对分析

2.5 盘基网柄菌HtrA2蛋白的系统进化分析

通过NCBI网站进行BLAST分析，结果表明，盘基网柄菌属（Dictyostelium）中D.discoideum种内两个菌株AX2和AX4属于同源（见下页图5）。

图5 盘基网柄菌HtrA2核苷酸序列的系统发育进化树

2.6 盘基网柄菌HtrA2蛋白的理化性质分析

利用Protparam软件分析盘基网柄菌HtrA2蛋白的理化性质，结果表明，HtrA2蛋白的分子量为72.17 kD，分子式为C3180H5047N895O996S13，理论等电点为5.90，含有257个非极性氨基酸（A、F、V、L、I、P、W和M）和390个极性氨基酸，其中包括66个酸性氨基酸（D和E）、70个碱性氨基酸（H、K和R）和254个非解离的极性氨基酸（N、C、Q、G、S、T和Y）。带负电荷的残基总数为66个，带正电荷的残基总数为58个。不稳定指数（instability index）为39.03，表明盘基网柄菌HtrA2蛋白相对稳定。其脂溶指数（Aliphatic index）为94.51，总疏水性平均值（Grand average of hydro‐pathicity，GRAVY）为-0.343。

2.7 盘基网柄菌HtrA2蛋白的跨膜区、信号肽分析及结构预测

蛋白跨膜区及信号肽研究分析结果表明HtrA2蛋白存在跨膜结构，且含有信号肽识别序列。利用SMART软件对HtrA2蛋白的结构域进行预测，结果表明，HtrA2蛋白存在明显的结构域，比如PDZ结构域，该结构域由103个氨基酸构成（350-453 aa）。

2.8 盘基网柄菌HtrA2蛋白的二级和三级结构预测

二级结构预测发现，盘基网柄菌HtrA2蛋白含α-螺旋142个，占21.95%；β-转角41个，占6.33%；无规卷曲302个，占46.68%；延伸链162个，占25.04%（见图6）。SWISS-MODEL检测结果显示了盘基网柄菌的立体空间结构模型如下页图7所示。

图6 盘基网柄菌HtrA2蛋白的二级结构预测

图7 盘基网柄菌HtrA2蛋白的三级结构预测

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究对盘基网柄菌HtrA2基因进行了克隆与生物信息学分析，结果表明，盘基网柄菌HtrA2基因全长2 023 bp，含1个内含子，共编码647个氨基酸。其核苷酸序列盘基网柄菌种内不同菌株之间完全相同，但不同属或种之间存在一定的差异性。蛋白质二级结构显示，盘基网柄菌HtrA2蛋白的分子量约为72.17 kd，其理论等电点为5.90，含390个非极性氨基酸和257个极性氨基酸，有明显的结构域，含信号肽识别序列且存在跨膜结构。HtrA2蛋白含α-螺旋142个，β-转角41个，无规卷曲302个，延伸链162个。

3.2 讨论

其他研究发现，人类HtrA2蛋白位于线粒体内膜间隙[21]。本研究利用软件进行预测发现，盘基网柄菌HtrA2蛋白存在跨膜结构，且其N端含信号肽识别序列，这进一步验证了HtrA2蛋白属于线粒体蛋白，因此具有跨线粒体膜序列和线粒体靶向基因序列。

HtrA2可能通过其丝氨酸水解酶活性在帕金森病的发生中起保护作用，而且通过对蛋白酶结构域S142和PDZ结构域S400进行磷酸化，其水解酶活性大大增强[22]。本研究发现盘基网柄菌HtrA2蛋白的空间结构除PDZ结构域外，还存在丝氨酸蛋白酶结构域，HtrA2通过对该结构域进行修饰或与其他结构域协作完成其生物学功能。

本研究克隆了盘基网柄菌HtrA2基因，并对其进行了序列测定和蛋白质理化性质分析、结构域、信号肽和空间结构预测。今后可以在此研究基础上进一步构建盘基网柄菌HtrA2基因的真核表达载体、在氧化和正常条件下通过控制盘基网柄菌细胞内HtrA2的表达水平，观察及测定盘基网柄菌的异常表现型，并建立其相关性、对盘基网柄菌HtrA2的催化位点进行突变，并进行对照分析，研究HtrA2对盘基网柄菌细胞进行保护的可能机制，从而为建立帕金森病相关基因HtrA2的盘基网柄菌模型奠定基础。