宏基因组二代测序在粒细胞缺乏伴发热患者病原菌 检测中的价值

温 静， 史 瑞， 谢 佳， 刘 锋， 李 光， 任婧婧， 雷小茹， 郭晓波， 宋艳萍

（西安市中心医院 西安市血液病研究所，陕西 西安 710002）

中性粒细胞缺乏伴发热在血液系统肿瘤患者中有着极高的发病率[1]。该病进展迅速，若得不到及时、有效的控制，可危及生命。中性粒细胞缺乏会使免疫反应被抑制，发热通常是感染的唯一表现，迅速鉴别和有效预防感染可以延长患者生存期，并提高生存质量[2]。目前，临床实验室主要依靠微生物培养、16S rRNA及免疫学相关检测寻找病原，但存在耗时长、敏感性和特异性差等不足，诊断通常具有局限性。为尽快控制感染，临床通常需要在准确的病原检测结果出来前采取经验性治疗，这也会导致一定程度的不合理治疗、诱导耐药、不可预期的不良反应及医疗资源浪费。所以，尽早明确病原至关重要[3]。

宏基因组二代测序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）技术能同时对上亿个微生物DNA片段进行检测，可直接从样本中提取微生物核酸，进行大规模、无差别的检测，利用检测信息，对照现有的数据库，分析出病原菌的种属，甚至可以预测病原菌的耐药情况[4]，目前已逐步应用于血液科、神经内科、感染科、重症监护病房、儿科患者病原的检测中[5-9]。但尚无mNGS用于检测化疗后粒细胞缺乏伴发热患者的报道。为此，本研究拟比较mNGS、传统微生物培养和免疫学相关检测检测病原的效能，为临床决策提供 参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

回顾性分析2019年6月—2020年9月西安市中心医院化疗后发生粒细胞缺乏伴发热的患者19例，其中男10例、女9例，年龄31～79岁。样本送检时患者中性粒细胞为（0.22±0.19）× 109/L，序贯器官衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）评分为（4.79±3.61）分，发热天数为（18.2±9.3）d。19例患者基本临床资料见表1。

1.2 病例入选、排除标准

1.2.1 入选标准 化疗后中性粒细胞＜0.5×109/L持续时间超过1周；不同日体温＞38 ℃ 3次。

1.2.2 排除标准 因各种原因拒绝进行相关 检查。

表1 19例患者基本临床资料

1.3 方法

1.3.1 mNGS （1）样本采集和处理：采集患者静脉血、脑脊液、胸腹水各3 mL，置于游离DNA样本保存管中。血液样本采集后置于抗凝管中，4 ℃ 425×g离心10 min，分离血浆后取500 μL血浆，再4 ℃ 27 173×g离心10 min，取上清450 μL，采用Magnetic Circulating DNA Maxi Kit[批号DP720，天根生化科技（北京）有限公司]提取循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）；取400 μL胸腔积液/腹腔积液或脑脊液样本，加入玻璃珠和裂解液混合破壁10 min， 采用Magnetic Circulating DNA Maxi Kit提取DNA，采用TIANamp Virus RNA Kit[批号DP315-R，天根生化科技（北京）有限公司]提取RNA。（2）文库构建与测序：采用ieff NGS Ultima DNA Library Prep Kit[批号12199，翌圣生物科技（上海）股份有限公司]构建cfDNA文库，采用TIANSeq DirectFast DNA Library Prep Kit[批号NG101，天根生化科技（北京）有限公司）]构建DNA文库，采用Hieff NGS Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit [批号12252，翌圣生物科技（上海）股份有限公司]构建RNA文库；采用NextSeq 550台式测序仪（美国Illumina公司）进行高通量测序。（3）数据分析：采用BWA软件（http://bio-bwa.sourceforge.net）将测序数据与人基因组进行比对，去除人源序列和重复序列，将剩余测序数据与细菌（10 537种）、真菌（903种）、病毒（8 472种）、寄生虫（288种）、螺旋体（89种）整合后的微生物数据库进行比对，确定检出微生物序列数，根据序列数和临床相关信息判断可能的病原。

1.3.2 微生物培养 采用无菌采血法采集患者高热、寒战但尚未使用抗菌药物时的血液样本8～10 mL，注入专用血培养瓶中（需氧瓶和厌氧瓶各1瓶），摇匀，2 h内送检。采用BACT/ACERT 3D全自动细菌监测系统（法国生物梅里埃公司）培养5 d。

1.3.3 免疫学相关检测 采用显色法真菌（1-3）-β-D葡萄糖监测试剂盒（天津丹娜生物科技公司）进行G试验，采用酶联免疫法曲霉菌抗原检测试剂盒（美国伯乐公司）进行GM试验。革兰阴性菌脂多糖（Gram-negative bacterium lipopolysaccharide，GNBL）检测：用一次性无菌、无热源真空采血管采集患者静脉血4 mL， 1 700×g离心10 min，收集血清0.1 mL，加入含0.9 mL样本处理液中混匀，70 ℃孵育10 min，取出后立刻放入冷却槽中5 min，制备成待测血清样本，取0.2 mL制备的血清样本直接加入酶反应主试剂中，溶解混匀后，用微量加样器全部移至（9×65）mm标准无热源平底试管中（不能产生气泡），立即采用MB-80微生物快速动态检测系统（北京金山川公司）进行检测。

1.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 20.0软件进行统计分析和制图。呈正态分布的计量资料用x ±s表示，2个组比较采用t检验，多组比较采用方差分析。计数资料用例表示，组间比较采用Fisher精确概率法或χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价mNGS、微生物培养和免疫学相关检测检出病原菌的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 送检样本类型

19例送检样本中，血液样本8例、咽拭子样本7例、脑脊液样本1例、胸腔积液样本和腹腔积液样本2例、尿液样本1例。

2.2 3种方法病原菌检测结果比较

19例样本中，mNGS、微生物培养、免疫学相关检测阳性率分别为68.4%、26.3%、63.2%。13例mNGS阳性样本中，10例检出革兰阴性菌、4例检出革兰阴性菌、4例检出真菌、3例检出病毒、1例检出支原体。见表2。

表2 19例样本mNGS、微生物培养、免疫学相关检测结果

续表2

2.3 3种方法检出病原菌所需时间比较

mNGS、微生物培养、免疫学相关检测检出病原菌所需时间分别为（47.0±13.2）、（84.0±31.6）、（24.8±16.4）h；与微生物培养比较，mNGS和免疫学相关检测所需时间更短（P＜0.05）；mNGS与免疫学检测所需时间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 3种方法病原菌检测效能比较

ROC曲线分析结果显示，mNGS、微生物培养、免疫学相关检测检出病原菌的曲线下面积分别为0.806、0.688、0.550；3种方法比较，敏感性和特异性差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1。

表3 3种方法检测病原的效能比较

图1 mNGS、微生物培养、免疫学相关检测检出 病原菌的ROC曲线

3 讨论

粒细胞缺乏伴发热是恶性肿瘤患者化疗后常见的并发症，在实体肿瘤患者中的发病率为40%～70%，而急性白血病患者的发病率高达80%[4-5]。多年来，临床对粒细胞缺乏伴发热患者的治疗策略是广覆盖抗感染治疗[6]，但导致粒细胞缺乏伴发热的病原菌种类繁多，尽早鉴别出病原菌种类对于有效治疗和改善预后有着至关重要的意义，对减少抗菌药物滥用、减少病原菌所致脏器毒性和节省医疗资源也有重要意义[7]。传统病原菌检测方法包括细菌学培养、免疫/血清相关抗原检测、分子生物学检测。然而，传统检测方法存在阳性率低、特异性差、耗时长等缺点，迫切需要新的检测方法[8]。

mNGS是一种新的病原菌检测技术，对待检样本进行全基因组测序，能够检出生长缓慢的病原菌，且不受抗菌药物干扰，还能够发现未知、罕见的微生物[9]。2008年，有学者首次通过mNGS技术检测出一种新型病毒——沙砾病毒，此后该方法逐渐被应用于感染性疾病的诊断[10]。

有研究发现，78.1%的中枢神经系统感染和35.7%的循环系统感染是通过mNGS诊断的，但在呼吸系统感染中，仅有21.4%是通过mNGS诊断的[7]，提示临床更倾向于将mNGS技术用于脑脊液和血液等相对无菌样本的检测。本研究19例样本中，有8例血液样本，但咽拭子样本也较多（7例），主要是因为部分患者存在明显的呼吸道症状，但因为化疗后粒细胞缺乏常合并血小板水平下降，无法耐受肺泡灌洗，所以送检样本类型为咽拭子。本研究同时对所有样本采用微生物培养、免疫学相关检测和mNGS进行检测，结果显示，mNGS阳性率为68.4%，与相关文献结果[11-13]一致。本研究发现，在13例mNGS阳性样本中，革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌、病毒、支原体检出例数分别为10、4、4、3、1例，与相关文献结果[1]一致。本研究19例样本中，7例检出单一病原，12例检出2种及以上病原，与相关文献结 果[14]一致。此外，在检测所需时间上，mNGS显著少于传统微生物培养（P＜0.05），但与免疫学相关检测比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究结合患者病史、实验室检查结果和临床表现，严格区分感染、定植、污染菌，ROC曲线分析结果显示，mNGS检出病原菌的敏感性为72.10%，特异性为68.46%，敏感性与微生物培养差异有统计学意义（P＜0.05），与相关文献结果（mNGS对病原菌检测的敏感性为50.70%～67.53%，特异性为68.75%～85.70%，敏感性与传统微生物培养差异有统计学意义）[10，15]一致。本研究结果显示，mNGS检测病原菌的约登指数显著高于微生物培养和免疫学相关检测，提示mNGS检测可靠性更高。

但mNGS检测也存在着一定的局限[16]，如测序结果解读、假阴性结果判读、成本高等，这些局限是未来改进的方向。本研究也有一定的不足之处，如样本量偏少，可能存在观察结果偏移，后续将扩大样本量进一步分析。同时，本研究未针对其他常见感染指标，如降钙素原、C反应蛋白、白细胞介素6、16s rRNA进行对照，这也是未来进一步分析的方向。

综上所述，mNGS能够提高化疗后粒细胞缺乏伴发热患者病原菌检出率，缩短检测时间、提高检测敏感性和诊断可靠性，在诊断化疗后粒细胞缺乏伴发热中具有一定的优势。