孕穗期低温对小麦幼穗发育及产量的影响

杨 丽 李 洋 王佳勤 张安民 黄正来 马尚宇 樊永惠 张文静

(安徽农业大学农学院，安徽 合肥 230036)

小麦(TriticumaestivumL.)在世界范围内种植较为广泛，总产量位居世界粮食作物第二[1]。低温胁迫是小麦生产的主要限制因素之一[2]，在3月下旬至4月上旬低温事件较为频发[3]，此时小麦处于孕穗期，低温胁迫对小麦生长发育及产量形成具有显著影响[4-5]。Ji等[4]研究表明孕穗期低温胁迫会严重影响小麦幼穗发育，最终导致产量降低。

植物光合产物主要以蔗糖的形式经维管束韧皮部从源运输到非光合库，在遭受低温胁迫后，维管束会出现木质部延伸现象，导致维管束结构改变，木质部排列紊乱[6]，进而阻碍蔗糖运输或减缓蔗糖运输速率。在高等植物中，蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)、磷酸蔗糖合成酶(phosphosucrose synthase, SPS)、尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase, UGP)以及转化酶(invertase, Inv)都是参与蔗糖代谢的关键酶。Wang等[7]研究表明番茄(LycopersiconesculentumMill.)经低温处理后叶片SS和SPS活性降低。有研究表明水稻(OryzasativaL.)受低温胁迫后，籽粒中SS和Inv活性下降导致蔗糖分解受阻，蔗糖含量明显积累[8]。孕穗期低温胁迫后小麦幼穗SPS活性增强，同时Inv活性下降[9]，低温胁迫时小麦分蘖节和叶片中UGP活性呈下降趋势[10]。Oliver等[11]对水稻花粉进行冷胁迫和脱落酸诱导研究，结果表明低温逆境中细胞壁转化酶基因表达受到抑制，进而导致了花药中糖运输受阻，造成花药中雄性不育。有研究表明小麦不育系花药中，低温胁迫使得细胞壁转化酶IVR1和IVR5基因表达下调，引起细胞壁转化酶活性降低，花药绒毡层和小孢子液泡中蔗糖水解阻滞，蔗糖利用受阻，进而导致花粉发育异常[12]。

植物内源激素脱落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellin, GA)和生长素(indole-3-acetic acid, IAA)是植物响应各种外界非生物或生物胁迫的重要调节因子，对植物发育及其对环境的适应有着极为重要的作用[13-14]。高琼等[15]通过分析拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)与烟草(NicotianatabacumL.) GA代谢发现低温胁迫下促进GA失活的酶基因表达上调，GA含量显著降低。也有研究表明，低温胁迫对孕穗期水稻叶片内源激素的影响显著，随着温度的降低，IAA、GA含量逐渐增加，而ABA含量逐渐降低[16]。Kosov等[17]研究表明短期低温胁迫后小麦ABA和GA含量增加，IAA含量降低，但随着低温时间的延长，ABA、细胞分裂素(cytokinin, CTK)和GA含量均呈现下降趋势。

综上所述，目前国内外针对春季低温对小麦生长发育、产量和品质的影响及其机理进行了大量研究，但孕穗期低温对小麦幼穗维管束数目、蔗糖代谢以及激素含量影响的相关研究较少。为此，本研究选用不同低温敏感型小麦品种作为试验材料，研究孕穗期低温胁迫对小麦幼穗穗轴输导结构、穗部蔗糖含量、蔗糖代谢相关酶活性和内源激素含量的影响，揭示孕穗期低温导致幼穗发育不良，造成产量降低的生理原因，以期为选育抗寒性小麦品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种烟农19(低温迟钝型)，由山东省烟台市农业科学研究院选育；皖麦52(低温敏感型)，由安徽省宿州市种子公司选育。

1.2 试验设计

试验于2018—2019年在安徽农业大学校内试验基地农萃园(31.83°N，117.24°E)进行。选用2个不同敏感型的小麦品种(低温迟钝型烟农19和低温敏感型皖麦52)进行大田盆栽试验，盆栽用桶为聚乙烯塑料桶，高25 cm、直径30 cm，桶底中央有6个排水孔。盆栽用土取自0～20 cm耕作层，土壤过筛后，每盆装土9 kg，然后将试验盆埋于试验田中，盆内表土与盆外土壤高度持平。播种前每盆施入有机肥75 g、尿素(含氮量46%)4.57 g、复合肥(N∶P∶K=17∶17∶17)7 g，覆0.6 kg沙土，播种后再覆0.9 kg沙土，并在小麦拔节期每盆追施尿素2.28 g，试验盆周围大田种植相同品种小麦，齐苗后间苗，每盆留苗10株，种植及栽培管理方式按照高产田块要求进行。

根据近年来春季低温发生的规律及小麦生长发育进程，结合显微镜观察于2019年4月1日(孕穗期)每品种小麦各取60盆置于人工气候室中，设置3个低温处理，每个处理20盆。18:00—次日6:00温度分别设置为-2、0和2℃，6:00—18:00温度均设置为5℃，气候室内相对湿度设置为70%，24 h低温处理结束后移回大田。以同品种未低温处理的样品作为对照(CK)，在低温处理期间使用Rc-4hc Elitech智能温湿度记录仪(江苏省徐州市江苏精创电器股份有限公司)每10 min 1次连续记录对照组小麦冠层温湿度变化，如图1所示。

1.3 测定项目与方法

低温处理结束后24 h，取大小一致的幼穗10～12个。为了分析不同穗位间的发育情况，将幼穗分为上中下3个穗位，上面的6～7个小穗称为上部穗，用US(upper spike)表示，中间的6～7个小穗称为中部穗，用MS(middle spike)表示，下面的6～7个小穗称为下部穗，用LS(lower spike)表示。取US、MS和LS中第1～第3位小穗和小花，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用以测定蔗糖代谢以及内源激素各个指标。

1.3.1 维管束形态 低温处理结束后24 h，取主茎穗和分蘖穗，剥离出幼穗穗轴，用2.5%戊二醛溶液固定12 h，0.1%磷酸缓冲液漂洗后，经脱水、包埋、切片、染色后用BXB51BXB52系统显微镜(日本Olympus公司)、S-4800扫描电子显微镜(日本Hitach公司)观察维管束显微及超微结构并统计10个小穗穗轴维管束数目。

1.3.2 蔗糖含量 蔗糖含量测定采用间苯二酚法[18]。每个处理测定3个重复，取平均值用于结果分析。

1.3.3 蔗糖代谢相关酶活性 参照陈功等[19]的方法，取1.0 g幼穗样品，加入10 ml缓冲液(pH值7.5)混合。在研钵内加入液氮研磨后，将磨好的样品在4℃下10 000 r·min-1离心10 min，所得上清液为粗酶液。使用Elisa试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)，按试剂盒操作步骤测定各处理小麦幼穗蔗糖代谢相关酶(SPS、SS、UGP、和Inv)活性。每个处理测定3个重复，取平均值用于结果分析。

1.3.4 转化酶基因IVR1和IVR5的表达特征 总RNA提取采用RNAiso Reagent试剂盒(日本TaKaRa公司)，RNA的反转录使用cDNA合成试剂盒(日本TaKaRa公司)，并按照说明书进行。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法测定基因的相对表达量，内参基因和引物参照Koonjul等[20]的方法，由上海生工生物工程股份有限公司合成。每个处理测定3个重复，取平均值用于结果分析。

1.3.5 内源激素含量 使用Elisa酶联免疫试剂盒(上海科顺生物科技有限公司)，按照试剂盒操作步骤测定小麦幼穗内源激素(ABA、IAA和GA)的含量。每个处理测定3个重复，取平均值用于结果分析。

1.3.6 产量构成因素 将孕穗期低温胁迫后的盆栽移回大田，每品种预留6盆不进行破坏性取样，待成熟期考种，供测定穗粒数、千粒重。

1.4 统计分析

采用Excel 2010软件进行数据处理，DPS和SPSS 26.0软件对试验数据进行显著性与相关性分析，其中相关性分析每个指标各个处理取3个重复，并采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 孕穗期低温胁迫对幼穗穗轴维管束的影响

由表1和图2可知，低温胁迫影响了小麦穗轴维管束形态和维管束数目。正常生长状态下，大、小维管束数由下往上数目逐渐减少。与对照相比，孕穗期 -2℃ 处理后，烟农19下部和中部穗轴大维管束数目变化不明显，但上部穗轴大维管束数目较对照显著减少了50%；小维管束数下部变化不明显，但中部至上部数目显著减少了50.27%。孕穗期-2℃处理后，皖麦52上中下部穗大小维管束数目与对照相比均显著下降。不同穗位间比较，低温胁迫对上部小穗维管束数目的影响大于中部和下部。不同品种间相比，低温胁迫对低温敏感型品种皖麦52幼穗穗轴维管束数的影响较大。

注：SVB和LVB分别表示大维管束和小维管束。Note: SVB and LVB represent the major and minor vascular bundles, respectively.图2 孕穗期低温对小麦穗轴维管束的影响Fig.2 Effects of low temperature at booting stage on vascular bundle of cob in wheat

2.2 孕穗期低温胁迫对幼穗中蔗糖含量的影响

由图3可知，孕穗期低温胁迫后，小麦幼穗中蔗糖含量增加，各温度处理与对照间差异均达到显著水平(P<0.05)，且随着处理温度的降低，蔗糖含量增加幅度上升。不同穗位间相比，上部穗幼穗中蔗糖含量较中部穗和下部穗增加幅度低。与对照相比，低温迟钝型品种烟农19经2、0、-2℃低温处理后，中部穗蔗糖含量分别显著增加37.45%、42.71%、65.50%；下部穗分别显著增加38.14%、43.25%、66.03%。低温敏感型品种皖麦52经2、0、-2℃低温处理后，中部穗蔗糖含量与对照相比分别显著增加39.84%、50.42%、69.72%；下部穗分别显著增加26.00%、43.64%、63.28%。

注：不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level between treatments. The same as following.图3 孕穗期低温对小麦幼穗蔗糖含量的影响Fig.3 Effect of low temperature at booting stage on sugar metabolism of young panicle of wheat

2.3 孕穗期低温胁迫对幼穗中蔗糖代谢相关酶活性的影响

由图4可知，在孕穗期2℃处理后，与对照相比，小麦幼穗中SS活性显著提高(P<0.05)；而0和-2℃处理后，SS活性与对照相比无显著差异。不同穗位间比较，SS活性增长幅度表现为上部穗>中部穗>下部穗。以皖麦52为例，经2℃处理后，上部穗、中部穗和下部穗中SS活性与对照相比分别显著提高25.31%、14.64%和8.82%。

图4 孕穗期低温对小麦幼穗蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)和蔗糖转化酶(Inv)活性的影响Fig.4 Effects of low temperature at booting stage on the activities of sucrose synthase (SS), sucrose phosphate synthase (SPS), UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) and sucrose invertase (Inv) in young panicles of wheat

孕穗期低温胁迫后，小麦幼穗中SPS活性提高，UGP、Inv活性均呈现下降趋势，与对照相比差异整体达显著水平(P<0.05)。且随着处理温度的降低，SPS活性增强幅度与UGP、Inv活性下降幅度均增大。不同穗位间比较，SPS活性变化表现为上部穗>中部穗>下部穗；两小麦品种UGP和Inv活性均表现为下部穗下降幅度最大。以皖麦52为例，经2、0、-2℃ 低温处理后，与对照相比，上部穗SPS的活性与对照相比分别显著提高14.03%、25.74%、42.89%；下部穗UGP活性分别显著降低9.51%、22.55%、34.92%，下部穗Inv活性分别显著降低11.31%、20.68%、26.36%。

2.4 孕穗期低温胁迫对幼穗IVR1和IVR5表达特征的影响

由图5可知，孕穗期低温胁迫后，小麦幼穗不同穗位IVR1与IVR5的表达量均呈下降趋势。不同穗位间比较，低温处理后两个品种上部穗与下部穗的IVR1与IVR5表达量相较于中部穗下降幅度更大。以皖麦52为例，经2、0、-2℃低温处理后，与对照相比，上部穗中IVR1的表达量分别显著降低了22.86%、32.18%、56.22%，IVR5的表达量分别显著降低了38.69%、48.70%、72.53%；中部穗中IVR1表达量分别显著降低了18.51%、28.13%、47.52%，IVR5的表达量分别显著降低了36.48%、47.39%、58.11%；下部穗中IVR1表达量分别显著降低了27.03%、37.32%、61.06%，IVR5的表达量分别显著降低了43.05%、50.37%、64.40%。

图5 孕穗期低温对小麦幼穗转化酶基因表达量的影响Fig.5 Effect of low temperature at booting stage on the expression of invertase gene in young panicle of wheat

2.5 孕穗期低温胁迫对幼穗中内源激素含量的影响

由图6可知，孕穗期低温胁迫后，小麦幼穗中ABA含量增加，IAA和GA含量均呈下降趋势。随着低温胁迫的加剧，ABA含量增加幅度与IAA和GA含量降低幅度均上升，且除皖麦52幼穗中GA含量，不同温度处理间的ABA、IAA和GA含量与对照相比均差异显著。不同穗位相比，下部穗中ABA含量上升幅度明显大于上部穗与中部穗；上部穗与下部穗IAA含量下降幅度明显高于中部穗；上部穗GA含量下降幅度低于中部穗。以皖麦52为例，经-2℃低温处理后，与对照相比，上部穗IAA和GA含量分别显著下降了58.23%、22.50%；下部穗中ABA、IAA和GA含量分别下降了66.11%、49.93%和19.81%。

图6 孕穗期低温对小麦幼穗中脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和赤霉素(GA)含量的影响Fig.6 Effects of low temperature at booting stage on contents of ABscisic acid (ABA), Indole-3-acetic acid (IAA) and gibberellin (GA) in young ears of wheat

2.6 孕穗期低温胁迫对产量构成因素的影响

由图7可知，孕穗期低温胁迫后，与对照相比，小麦穗粒数和千粒重均显著下降(P<0.05)，且随着处理温度的降低，穗粒数和千粒重下降幅度增加。低温敏感型品种皖麦52经过2、0、-2℃处理后，穗粒数与对照相比分别显著下降6.65%、13.34%、24.71%；千粒重与对照相比分别显著下降3.15%、9.23%、18.82%。不同品种间相比，敏感型品种皖麦52穗粒数与千粒重下降幅度均高于迟钝型品种烟农19。

图7 孕穗期低温对小麦产量构成因素的影响Fig.7 Effect of low temperature at booting stage on wheat yield componentst

2.7 产量因素与蔗糖代谢酶活性和内源激素含量的相关性分析

对两个小麦品种产量因素与蔗糖代谢相关酶活性和激素含量进行相关性分析，结果见表2。孕穗期低温胁迫后，蔗糖含量、SPS活性和ABA含量分别与穗粒数、千粒重呈极显著负相关(P<0.01)，而UGP活性、Inv活性、IAA含量和GA含量分别与穗粒数、千粒重呈极显著正相关。

表2 产量因素与蔗糖代谢相关酶活性和激素含量的相关性分析Table 2 Correlation analysis of yield factors with sucrose metabolism-related enzyme activities and hormone content

3 讨论

3.1 孕穗期低温胁迫对小麦穗轴维管束的影响

维管束是碳水化合物的运输通道，其结构和发育状况直接影响着碳水化合物的运输与积累，进而影响小麦的发育与粒重的形成[21]。李金才等[22]对小麦穗轴进行解剖试验发现维管束数目与小穗结实粒数和粒重呈极显著正相关。本试验电镜结果显示，孕穗期遭受低温胁迫后，小麦幼穗穗轴大小维管束数目减少，结构受损，抑制了幼穗同化物的正常运输，降低了小麦小花发育的营养供给，进而影响了小麦穗粒数及粒重的形成。这与水分胁迫下小麦幼穗维管束的变化一致[23]。前人研究发现，小麦小花中维管束数目与类型受IAA和蔗糖含量共同影响，蔗糖含量高会抑制维管束的分化，IAA含量升高则会促进维管束的分化[24]。本试验结果显示低温胁迫后幼穗蔗糖含量增加，可能反向抑制了小麦幼穗穗轴维管束的分化。

3.2 孕穗期低温胁迫对小麦穗部蔗糖代谢及相关酶活性的影响

蔗糖是遭受低温胁迫后细胞内产生的保护物质。蔗糖含量的增加是小麦应对孕穗期低温胁迫的自我调节机制[25]。本试验结果表明，孕穗期低温胁迫下，小麦小穗中蔗糖含量增加，而较高的蔗糖含量有利于小麦应对低温逆境[26]。本试验结果显示低温迟钝型小麦品种的蔗糖含量上升幅度高于低温敏感型小麦品种，说明低温迟钝型小麦品种在低温逆境中能够更好地通过蔗糖调节物质分配来应对胁迫，这与王树刚等[27]的研究结果一致。

在孕穗期低温胁迫下，小麦会通过控制蔗糖代谢相关酶活性来确保组织内产生大量的蔗糖等渗透调节物质，以减少低温胁迫对植物造成的损伤，提高抗寒性[9,28]。研究表明，烟草和玉米受低温胁迫后，叶片中促进SPS酶合成的基因表达上调，SPS活性增加[29-30]。SS活性与蔗糖含量变化不同，也证明低温条件下，SS主要参与蔗糖水解的过程，而非在合成过程中发挥作用[31]。在低温胁迫下，由Inv和单糖蛋白参与运输的质外体运输途径受到抑制，影响了蔗糖向花药的运输[32]。本试验发现，小麦幼穗中Inv活性均随着温度的降低而下降，而Inv活性降低导致小麦幼穗中蔗糖水解阻滞，蔗糖代谢异常，可能致使小花败育，穗粒数降低[9]。拟南芥UGP基因缺失造成雄性不育[33]，表明UGP参与花粉发育过程。刘丽杰等[34]研究表明低温抑制了小麦叶片和地下茎中UGP在蔗糖合成中的作用。本试验中，在低温胁迫下UGP活性下降，使得二磷酸尿苷葡糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)合成速率降低，UDPG作为蔗糖降解的底物，使得蔗糖降解速度下降，蔗糖含量提升，与刘丽杰等[34]研究中得到的蔗糖含量变化趋势一致。进一步说明低温导致UGP活性下降，不利于花粉正常发育，可能是导致穗粒数下降的原因之一。

3.3 孕穗期低温胁迫对小麦转化酶相关基因定量表达情况的影响

研究发现，细胞壁转化酶和液泡转化酶参与了花发育的早期阶段[35]。在植物授粉之前，转化酶参与了花药和子房的己糖供应过程[36]，其中IVR1和IVR5均在碳水化合物的利用方面发挥关键作用，前者主要调节蔗糖代谢，而后者主要在细胞代谢方面发挥作用[37]。相关研究显示，在小麦花药绒毡层和小孢子中特异表达的IVR1和IVR5可对其糖运输进行特异调节[20]。本试验表明，低温胁迫对小麦幼穗中IVR1和IVR5的表达有明显的抑制作用，从而导致蔗糖无法正常转运至小花，致使小花发育受阻；孕穗期低温胁迫后，穗轴维管束数目降低，幼穗中蔗糖代谢相关酶活性发生显著变化；转运酶Inv活性下降，转运酶相关基因IVR1与IVR5表达量下调，蔗糖代谢受阻。同时UGP活性下降，表明蔗糖降解的底物含量下降，可引起UGP反应向UDPG合成方向移动，从而使蔗糖含量升高。

3.4 孕穗期低温胁迫对小麦内源激素的影响

低温胁迫使植物体内激素的含量发生变化，进而调控其代谢活动，维持正常的生理机能[16,38]。有研究表明小麦幼穗内源激素在小麦小花发育过程中对小麦穗粒数具有调控作用[39]。王兴等[40]发现在低温胁迫下，小麦IAA含量会随温度的降低而降低。小麦小穗的分化发育受内源GA水平的控制。抑制内源促生GA信号通路可显著提高植物在低温、高盐、干旱胁迫下的存活率[41]。此外，有研究表明低温胁迫下，水稻花药内源激素GA含量降低，导致小花败育，穗粒数严重下降[42]；而外施GA处理能使低温下花粉可育程度增加，进而增加结实率[43]。本研究发现孕穗期低温胁迫后，小麦幼穗中IAA和GA含量均大幅下降，导致穗部养分输入的不足，降低小麦小花可育性，最终造成产量下降，且以小麦上部和下部幼穗下降幅度较大，这与Zhang等[5]的研究结果一致。可见低温胁迫对小麦幼穗上部及下部的小花发育影响更大。

ABA作为胁迫激素，在低温胁迫的响应中起着重要作用。有研究发现内源激素ABA含量积累可诱导胁迫基因表达，增强抗寒性[44]。本试验结果表明，低温胁迫下，小麦幼穗中ABA含量增加，且增加幅度随着处理温度的降低而加大。低温下ABA含量增加可能会放大ABA信号，诱导下游ABA应答耐低温相关基因表达量发生改变，使植物低温耐受性增强。从而表明ABA在小麦幼穗中的积累与植株抗寒性的增强相关，这与Zhang等[9]和齐付国等[38]的结论一致。

3.5 孕穗期低温胁迫对小麦产量及其构成因素的影响

研究表明，孕穗期低温胁迫对小麦穗数和穗粒数有显著影响[27,45]，尤其是孕穗期低温胁迫可导致小麦穗粒数降幅达55%[45]，这也是低温胁迫下小麦产量降低的主要原因。本试验发现，孕穗期低温胁迫会使小麦穗粒数显著降低，且胁迫温度越低，对产量的影响越大，这与李春燕等[46]的研究结果一致。

4 结论

孕穗期低温胁迫后，小麦幼穗穗轴维管束数目下降；幼穗中参与蔗糖代谢的相关酶活性及基因表达量发生变化，参与蔗糖合成的SPS活性提高，参与蔗糖分解的Inv和SS活性均下降，小花中转化酶基因IVR1和IVR5的表达受到抑制，诱导了幼穗中蔗糖含量的积累；幼穗中促进生长的植物激素IAA和GA含量下降，抑制生长的ABA含量上升。孕穗期低温胁迫后，由于幼穗穗轴维管束数目下降、幼穗中蔗糖代谢和相关酶基因及激素含量发生变化，最终导致小麦穗粒数和千粒重均下降。