利用菊花B病毒外壳蛋白特异片段进行多克隆抗体的制备与分析

王 玮 杜雪洁 陈卫良 陈正贤 毛碧增

(浙江大学生物技术研究所/农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室/浙江省作物病虫生物学重点实验室，浙江 杭州 310058)

杭白菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)因具有散风清热、平肝明目、清热解毒等药理作用深受人们的喜爱[1-3]。杭白菊生产中主要以扦插、分株等无性繁殖方式繁殖种苗，但该方法会使植物病毒随着繁殖代数增加而积累，严重降低菊花的产量和品质。菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)是危害最严重的病毒之一。菊花感染CVB后，轻症表现为叶片斑驳，重症表现为花朵畸形和重度花叶[4]。据报道，CVB在全球各地的菊花基地普遍存在，严重阻碍了菊花产业健康持续发展[5]。

CVB是乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)的成员。其病毒粒子呈略弯曲线状，长度为685 nm，直径为12 nm，常分散于寄主组织的细胞质中。CVB病毒基因组长约8.8 kb，为正单链RNA[6-7]。病毒基因组包含6个开放阅读框(open reading frame，ORF)。ORF5编码的外壳蛋白(coat protein，CP)是该病毒编码病毒外壳的唯一亚基，大小约为34 kDa[6,8-9]。CVB的钝化温度范围为70～75℃[10]。

目前病毒的检测方法有逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、电镜检测法、血清检测、环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等[11]，其中血清学检测因其成本低、操作简便等优点受到广泛的关注。血清学检测所用抗体包括多克隆抗体(polyclonal antibody，PAb)和单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)，但多克隆抗体可以识别多个表位，可能会导致高度交叉反应，造成其特异性较差，从而限制了其应用[12]。上世纪60年代，Hakkaart等[13]利用菊花B病毒粒子制备多克隆抗体，检测发现制备的抗体无法有效区分菊花B病毒与马铃薯M病毒、香石竹潜隐病毒和马铃薯S病毒。Singh等[14]通过在大肠杆菌中表达CVB CP，制备多克隆抗体，但研究缺少特异性方面的相关分析。单克隆抗体针对单一抗原决定簇，特异性较好，但操作简单复杂，对设备的要求较高[15-16]。

因此，本研究利用基因工程的方法表达特定的单一抗原决定簇，用多克隆抗体的制备方法获得单克隆抗体的效果，从而简便地获得具有高特异性的抗体。具体思路为分析CVB CP的三维空间结构，根据其外露基团的氨基酸序列，设计相应的特异DNA序列片段，通过在大肠杆菌中表达融合蛋白，以此作为抗原，免疫新西兰大白兔，对获得的抗血清和纯化后获得的抗体进行效价、特异性等分析，旨在为CVB的田间快速检测和科学防治提供技术支撑，也为今后利用多克隆抗体制备途径获得特异性抗体研究提供思路和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

感染CVB的菊花叶片采自浙江桐乡杭白菊生产基地。感染甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)的甘薯叶片、感染马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)的烟草叶片均保存于浙江大学生物技术研究所。

E.coliBL21(DE3)和DH5α感受态细胞，北京擎科生物；pET-28a表达载体，湖南优宝生物；DNA Marker、T4连接酶，宝日医生物(北京)有限公司；BamHI和XhoI限制性内切酶，美国Thermo fisher；HRP标记羊抗兔IgG，北京康为世纪；双组份TMB显色液，北京博奥森公司；ECL发光液，杭州弗德生物；Ni-NTA重力柱、Protein A亲和层析柱，常州天地人和公司。

1.2 仪器与设备

imark酶标仪，美国Bio-rad公司；5424高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1CVBCP基因片段的选择与合成 根据已报道的CVB CP序列(UniProt登录号A0A3G5AWF4)，本研究利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)分析CVB CP空间结构，选择暴露在分子表面的基团，该基团由25个氨基酸组成，并根据大肠杆菌密码子的偏爱性，优化该基团的DNA序列。DNA合成时将选择的75 bp的DNA序列片段重复4次，片段之间用10氨基酸长度的连接链(NH2- GGGGSGGGGS-COOH)串联以提高柔性。序列两端分别添加限制性内切酶BamHI(5′-GGATCC-3′)和XhoI(5′-CTCGAG-3′)的酶切位点。

1.3.2CVBCP基因片段表达载体的构建与克隆 将合成的目的DNA片段和pET-28a(+)质粒用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后通过DNA回收试剂盒纯化[宝日医生物(北京)]，使用T4连接酶，16℃条件下连接5 h。连接产物转化E.coliDH5α，涂布于含有卡那霉素的溶菌肉汤(Luria-Bertani，LB)固体培养基，然后挑选单克隆进行双酶切验证。将经验证的重组质粒命名为pET-28a-CVB。将构建的重组质粒pET-28a-CVB转入BL21(DE3)感受态细胞中，获得阳性克隆。

1.3.3 阳性克隆的表达及SDS-PAGE检测 将阳性克隆按1%(V/V)比例接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃、150 r·min-1条件下震荡培养至OD600值为0.4～0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)至终浓度1 mmol·L-1，于37℃、200 r·min-1条件下继续培养4 h，以不加IPTG为对照。培养后，菌液于12 000 r·min-1下离心10 min，弃上清。所得菌体用超声破碎法裂解，12 000 r·min-1下离心10 min，所得上清液即为提取粗提液。取8 μL粗提液加入2 μL 5 × Loading Buffer沸水煮沸10 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel，SDS-PAGE)分析。

1.3.4 表达蛋白的提取与纯化 根据操作指南利用Ni-NTA重力柱纯化粗提液获得目的蛋白，通过SDS-PAGE分析其纯度。

1.3.5 抗血清的制备和效价分析 用纯化的表达蛋白(1 mg·mL-1)作为免疫原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。具体方法如下：将1 mg纯化蛋白和完全佐剂(初次免疫)或不完全佐剂(增强免疫)等量混合均匀，进行皮下多点注射，每点为0.2 mL，共进行4次免疫，首免后第14天进行二免，二免到四免间隔时间为7 d。7 d后采集全血，分离得到抗血清。取1 μg纯化的表达蛋白为抗原，抗血清按4倍梯度从1∶500稀释至1∶2 048 000，间接酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定抗血清的效价[17]。

1.3.6 抗体的制备和蛋白免疫印迹法(western blot, WB)检测 用Protein A亲和层析柱纯化兔抗血清，从而获得兔抗CVB多克隆抗体IgG。以纯化抗体(1∶1 000 稀释)为一抗，以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔为二抗，进行抗体B检测[18]。

1.3.7 CVB CP多克隆抗体的特异性检测 称取0.1～0.2 g健康和感染CVB的菊花叶片、感染SPFMV的甘薯叶片、感染PVX的烟草叶片，加入液氮研磨，提取总蛋白。蛋白样品经煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳。采用湿转法将胶中蛋白转至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美国Millipore公司)上，然后将膜浸没在5%脱脂牛奶中，4℃条件下过夜封闭。以制备的CVB CP多克隆抗体作为一抗(1∶1 000)， HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗(1∶5 000)， 通过增强化学发光(enhanced chemi luminescence，ECL)显色试剂盒(杭州弗德生物)按说明书显色。

2 结果与分析

2.1 CVB CP片段的选择与合成

利用SWISS-MODEL分析，获得CVB CP空间结构，根据亲水性和二级结构域选择了一个裸露在外由25个氨基酸(L N K A Y N N D T F G N F D S A I T G G R Q G PA)组成的基团(图1)。根据大肠杆菌密码子的偏爱性，对25个氨基酸基团对应的75 bp DNA序列进行优化，通过连接链(NH2-G G G G S G G G GS-COOH)串联的方法将4段75 bp 的DNA序列片段进行组合，两端添加限制性内切酶酶切位点，序列见图2，委托杭州华安公司合成。

注：圆圈所示为选择的基团。Note: Circle indicates the chosen group.图1 CVB CP的三级结构以及选择基团Fig.1 Tertiary structure of CVB CP and the chosen group

2.2 CP片段表达载体的构建与鉴定

将目的片段和pET-28a(+)质粒用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切，回收后用T4连接酶连接。连接产物转化E.coliDH5α，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，然后挑选单克隆提取质粒。用BamHI和XhoI双酶切重组质粒，获得402 bp大小的预期目的片段(图3)，表明原核表达载体构建成功，将经过验证的重组质粒命名为pET-28a-CVB。

注：M：DNA Marker；1：未经酶切的pET-28a-CVB质粒；2：双酶切后的 pET-28a-CVB质粒。Note: M: DNA Marker. 1: Recombinant plasmid pET-28a-CVB without enzyme digestion. 2: Double enzyme digestion of recombinant plasmid pET-28a-CVB.图3 pET-28a-CVB的双酶切验证Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-28a-CVB by double enzyme digestion

2.3 重组蛋白的原核表达

将pET-28a-CVB质粒转化大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)，在37℃条件下LB中震荡培养至OD600值为0.4～0.6时，加入IPIG至终浓度为1 mmol·L-1，继续培养4 h，收集菌体进行SDS-PAGE电泳。在IPTG诱导下，发现在14 kDa左右位置有一条特异性蛋白条带，表明目的蛋白表达成功(图4)。

注：M：蛋白Marker；1：未经IPTG诱导；2：经1 mmol·L-1IPTG诱导。Note: M: Protein Marker. 1: Induced without IPTG. 2: Induced by 1 mmol·L-1 IPTG.图4 重组蛋白的原核表达Fig.4 Prokaryotic expression of recombinant protein

2.4 重组蛋白的纯化

用镍离子亲和层析柱进行纯化后得到了高纯度的表达蛋白，发现在14 kDa左右位置有特异性蛋白条带，表明目的蛋白纯化成功(图5)。

注：M：蛋白 Marker；1：纯化后的重组蛋白。Note: M: Protein Marker. 1: Purified recombinant protein. 图5 重组蛋白的纯化Fig.5 Purification of recombinant protein

2.5 抗血清效价分析

以纯化的表达蛋白为抗原，免疫新西兰白兔获得抗血清。抗血清梯度稀释后，进行间接ELISA检测，所用抗原为1 μg纯化的表达蛋白。使用酶标仪读取450 nm处的OD值(表1)，以N表示阴性血清的OD平均值，以P代表阳性样品的OD平均值，若P/N>2.0，则视为阳性，否则为阴性[17]。结果表明，抗血清经512 000倍稀释，仍能检测到1 μg抗原。

表1 不同稀释倍数下的OD450值Table 1 Determination of OD450 value at different dilution times

2.6 抗体的制备和WB检测

抗血清用Protein A亲和纯化后，得到浓缩后的抗体IgG，浓度为15.0 mg·mL-1。

分别取10、5、1、0.5 ng抗原，将获得的抗体进行 1∶1 000 稀释，并进行WB检测，结果如图6。结果表明，0.5～10 ng的抗原均检测到特异性条带，说明制备的CVB CP片段多克隆抗体具有较高的检测敏感度。

图6 抗体的WB检测Fig.6 Antibody detection by WB

2.7 多克隆抗体对植株病毒的特异性检测

分别提取0.1～0.2 g健康菊花叶片、感染CVB的菊花叶片、感染SPFMV的甘薯叶片、感染PVX的烟草叶片的总蛋白，进行SDS-PAGE电泳和转膜，以 1∶1 000 比例稀释的纯化好的抗体为一抗，进行WB检测。结果发现，抗体与感染CVB的菊花样品在预期大小位置处发生特异性反应，而与健康菊花样品、感染SPFMV的甘薯样品和PVX的烟草样品无交叉反应，表明抗体能够特异性结合CVB CP，具有良好的特异性(图7)。

注：M：蛋白Marker；1：健康菊花；2：感染CVB的菊花；3：感染SPFMV的甘薯；4：感染PVX的烟草。Note: M: Protein Marker. 1: Healthy chrysanthemum. 2: Chrysanthemum infected with CVB. 3: Ipomoea batatas Lam infected with SPFMV. 4: Nicotiana benthamiana infected with PVX.图7 兔多克隆抗体对植株病毒的WB检测Fig.7 WB of plant viruses using rabbit polyclonal antibody

3 讨论

至今已知侵染菊花的病毒达20多种。目前我国已报道存在的菊花病毒病有12种[19-24]。其中CVB是浙江省桐乡基地中最常见的病毒，给当地杭白菊产业带来了极大的危害。快速特异性检测CVB在生产上具有重要意义。其中血清学检测因其具有操作简便、成本低等优点，如今已在病毒检测方面得到了广泛的应用。病毒的CP参与了侵染寄主的过程[25]，同时也常作为植物病毒血清学检测的靶位，如香蕉条纹病毒(banana streak virus，BSV)、辣椒轻度斑驳病毒(pepper mild mottle virus，PMMoV)、马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus，PLRV)，洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus，OYDV)等[26-29]。但传统方式制备的多克隆抗体，因其可以识别多个抗原决定簇，导致其特异性较差。目前鲜见针对CVB CP单一抗原决定簇制备抗体的报道。

相比多克隆抗体，单克隆抗体的优点在于特异性高、生物活性完全相同、理化性状一致、产量高、重复性强等，但其生产周期长、成本高、对技术要求高[30]。本研究利用基因克隆和基因表达的方法获得特定的单一抗原决定簇，用多克隆抗体的制备方法获得相应的CVB抗体，从，结果看该途径制备成本较低，获得的抗血清具有很高的效价(达到1∶512 000)、特异性强，由此可见本研究的研制途径是科学合理的，可为今后类似研究提供思路和借鉴。由于实际生产中，菊花中病毒浓度较低，传统纯化病毒的方法很难获得足量抗原，所以利用分子生物学技术在大肠杆菌中过表达目的蛋白，从而获得大量高纯度抗原的方法得到人们的青睐[31]。

SWISS-MODEL是全球第一个可用于蛋白质同源建模的全自动服务器，其在生成模型响应时间、结合位点和四维结构预测的模型质量以及可信度方面都表现出色，已成为应用最普遍的建模服务平台之一[32-33]。在SWISS MODEL中输入CVB CP氨基酸序列后，获得的三维结构包括一段21个氨基酸组成的外露基团，构成了相对完整的二级结构，同时该片段具有亲水性，因亲水性片段容易形成抗原识别位点，推断其具有较好的免疫原性。为了保护抗原决定簇的稳定性，选择片段时在外露基团左右二侧各增加2个氨基酸序列，最终组成了含25个氨基酸的序列；为了提高抗原的免疫原性，将4个设计的氨基酸序列组合；为了保证融合蛋白的稳定性及生物活性，在片段之间添加了由甘氨酸和丝氨酸残基伸展组成的柔性连接肽(GGGGSGGGGS)[34]。同时结合大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了相应的DNA序列。结果表明，本研究制备的抗体具有高效价且可以与CVB CP特异性结合，证明该设计是合理、可行、经济的。

4 结论

本研究根据SWISS-MODEL分析CVB CP空间结构，选择暴露在外的片段进行DNA序列的优化与合成，连接到表达载体pET-28a(+)，在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中获得了理想的表达，并通过镍离子亲和层析柱获得了高纯度的表达蛋白，进而制备了特异性多克隆抗体。ELISA和WB分析表明，本研究所制备的抗血清具有高效价且纯化获得的抗体能特异结合天然病毒蛋白，可用于检测植物材料中的CVB。