基于计算机辅助药物设计的新冠病毒抑制剂的虚拟筛选及其活性验证

李 震，王 瑞

(聊城大学 药学院，山东 聊城 252059)

由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎已经成为一个世界性安全问题，给世界各国经济带来了巨大的损失[1]。虽然疫苗的特异性强，但其研发成本高且周期长，而且RNA病毒的变异速度较快，这使疫苗的有效性大大降低[2，3]。针对新冠病毒如此高的变异速度，当务之急是研发一种既对当前的病毒有效，也对变异的病毒有治疗效果的“特效药”。有研究表明，病毒入侵细胞时，首先病毒S蛋白RBD与人体细胞的表面受体ACE2结合，随后病毒膜和细胞膜融合，病毒被内化进入细胞，在细胞内进行转录和复制，重新组装成大量新的病毒，又去继续感染其他细胞。S蛋白受体结合域(RBD)与血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合是SARS-CoV-2进入宿主细胞的方式[4，5]，不管病毒是否变异，均主要通过此种方式入侵细胞，故可以针对这种结合方式设计一种抑制剂阻断两者结合，从而阻止新冠病毒进入宿主细胞。小分子抗病毒药物在治疗由病毒引起的疾病方面有着举足轻重的地位。瑞德西韦、洛匹那韦、 依米丁、高三尖杉酯碱等多种小分子抗病毒药物已被证明可以抑制病毒的复制，其中瑞德西韦是2019年批准的第一种治疗新冠病毒的药物[6，7]。小分子抗病毒药物在阻断蛋白与蛋白结合方面效果欠佳，而多肽药物在这方面具有明显的优势[8]。PDB(Protein Data Bank)蛋白质结构数据库中编号为6M0J的RBD与ACE2的热点结合残基通过100 ns的分子动力学模拟已分析得到[9]，ACE2中的一段多肽(a.a.21～43)已被验证具有阻断RBD与ACE2结合的活性，且27～38这段多肽不能与RBD结合[10]，通过对接也验证了这一点。通过丙氨酸扫描，三种不同的对接方式以及50 ns的分子动力学模拟验证了两条肽段(18肽：28～45和23肽：23～45)具有相近的结合效率[11]。肽的长度虽然缩短，但对结合效率的影响较小，提示或许存在一条更短的多肽仍具有阻断病毒入侵的能力。本研究使用DS软件确定最佳多肽对接分数，通过突变提高多肽的亲和力，设计了一系列长度较短的多肽并通过对接和体外细胞实验进行筛选，这将为新冠病毒的治疗提供新的方式。

1 材料和方法

1.1 细胞、试剂与仪器

293T细胞(中国科学院细胞库)；293-ACE2细胞(上海药物所)；多肽合成(南京肽业生物科技有限公司)；新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus (GFP)(吉满生物科技(上海)有限公司GM-0220PV07)；DMEM培养基(美国Thermo Fisher Scientific(GIBCO))；胎牛血清(美国Thermo Fisher Scientific(GIBCO))；MTT(上海阿拉丁试剂有限公司)；DMSO(上海阿拉丁试剂有限公司)；RG005萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)。二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher Scientific)；CKX53倒置显微镜(日本Olympus公司)；ImageXpress Micro Confocal高内涵成像分析系统(美谷分子仪器(上海)有限公司)；XP6百万分之一超微量天平(德国梅特勒公司)；多功能微孔板检测Synergy H1(美国Biotek公司)。

1.2 多肽设计、筛选与验证

1.2.1 三维结构准备。从PDB蛋白质结构数据库[12]中检索到了ACE2-RBD复合物的三维结构(PDB编号：6M0J)用于肽段的设计和开发。使用DS软件对6M0J蛋白质复合物进行预处理[13]。所有设计的肽的复杂结构均是从与SARS-CoV-2-RBD结合的ACE2-PD的螺旋的晶体结构中获得，同时查看RBD和ACE2的结合位点。

1.2.2 初始构象设定。将热点残基设置为结合位点，同时均方根误差截止值(RMSD Cutoff) 设置为6.0；相互作用面的截止距离(Interface Cutoff)设置为9.0；最大分组数(Maximum Number of Clusters )设置为60，进行ZDOCK对接。同时在对接的蛋白质姿势的初始排名中使用形状互补性，去溶剂化作用和静电能。使用默认参数将对接结果中ZRank分数[14]排名前10的构象进行RDOCK对接，来对构象进行优化，参数为默认参数。使用蛋白质叠合工具对RDOCK对接结果产生的构象进行叠合，同时以6M0J原始构象为基准计算各构象的RMSD值。

1.2.3 多肽重设计。使用DS软件的计算突变结合能(Calculate Mutation Energy (Binding))模块先进行单点突变(丙氨酸扫描)[15]，然后对非关键的氨基酸残基进行三点突变，其余参数为默认参数。使用DS软件的侧链重设定(Side-Chain Refinement)功能[16]对突变后的配体构象进行优化，参数为默认参数。使用DS软件的能量最小化(Full Minimization)模块对配体和受体结合的复合物进行能量最小化，参数为默认参数。

1.2.4 CDOCKER对接。使用DS软件的CDOCKER对接模块对30～38的原始序列，最佳三种突变方式以及最差的一种突变方式与RBD进行CDOCKER对接，最大最佳构象数量(Top Hits)设置为100，其余参数为默认参数。

1.3 体外细胞实验

1.3.1 细胞培养。293T细胞和293-ACE2细胞均使用DMEM培养基(含10%的胎牛血清)培养，培养温度为37 ℃，二氧化碳浓度为5%。显微镜下观察细胞，选择生长状态良好的细胞，密度达到80%～90% 即可传代，传代时用0.25% 胰酶消化细胞，制备单细胞悬液进行细胞计数(4个大方格细胞数的均值×104为每mL所含细胞数)。根据细胞计数的结果，将适当数量的细胞悬液按照实验需要接入含有新鲜培养液的培养瓶、培养皿或细胞培养板中，补足培养基，放入37 ℃，5% CO2培养箱培养，以备实验所需。

1.3.2 MTT实验。将对数生长期的293-ACE2细胞以3 000/孔接种于96孔培养板中，每组设计4个复孔，37 ℃，5% CO2培养24 h后，每孔分别加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L的多肽，37 ℃，5% CO2培养48 h。每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)处理4 h后，去掉培养基，每孔加入120 μL DMSO，轻微震荡10 min，在490 nm的波长下测定OD值读数，同时设置调零孔，对照孔，重复实验三次。计算相对细胞存活率 Relative survival/control=测试组OD值/对照组OD值。

1.3.3 多肽活性测定。将对数生长期的293T和293-ACE2细胞以5 000/孔接种于96孔培养板中，每组设计2个复孔，37 ℃，5% CO2培养24 h。将不同浓度的多肽与带有绿色荧光标记的新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus(GM-0220PV07)孵育10 min后加入细胞，同时设置对照孔，37 ℃，5% CO2培养48 h，ImageXpress Micro Confocal高内涵成像分析系统拍照，并进行荧光检测，计算相对荧光强度 Fluorescence relative to control =测试组荧光值/对照组荧光值，重复实验三次。

1.3.3 统计学分析。实验所得数据均以平均值(Mean ± SD)表示，各组数据差异性比较采用t-test(非参数检验)方法进行分析，p>0.05表示差异性不显著；*，0.01

2 结果

2.1 初始构象设定

使用DS软件查看6M0J中RBD与ACE2的结合残基，与已报道的关键残基基本一致，将这些残基设置为结合位点进行ZDOCK对接，共产生2 000个构象。将结果中Zdock值前10的构象与6M0J进行叠合后发现对接结果较好，这10个构象的RMSD值有9个小于0.2 nm，其中有4个构象的RMSD值小于0.1 nm，如表1所示。再次使用DS软件查看这4个构象的结合残基并与已有报道中的关键残基进行比较，如表1所示。结果显示Pose2与关键残基相比，缺少19，355，387，但这三个残基是氢键维持时间最短的三个；Pose3缺少19，35，37，38，41，355，387；Pose4缺少35，37，41，42，355，387；Pose5缺少35，37，355，387，除Pose2外都涉及较重要的关键残基。而比较RMSD值，Pose2的也是最小的。同时计算RBD与ACE2的结合力为-57.347 48 kcal/mol。综上，选择Pose2中RBD-ACE2复合物的构象作为初始构象，并将对接结果作为参照。

表1 Zdock分数排名前10且RMSD值小于1的4个构象以及原始构象的结合位点

2.2 初始肽段构建

图1 ACE2、21～43、27～38、30～38与RBD对接后亲和力计算

ACE2中的一段多肽(a.a.21～43)已被验证具有阻断RBD与ACE2结合的活性，且27～38这段多肽不能与RBD结合[10]。使用这两段已被验证亲和力的多肽(a.a.21～43 和a.a.27～38)与RBD进行对接，并与初始构象的对接结果进行比较，以验证通过对接设计多肽抑制剂的可靠性，如表2所示。结果显示21～43肽段的对接结果确实和RBD与ACE2的对接结果相当，而27～38肽段的对接结果较差，通过计算亲和力得知，RBD与ACE2的亲和力为-57.347 48 kcal/mol，21～43肽段与RBD的亲和力为-60.384 57 kcal/mol，27～38肽段与RBD的亲和力为-38.220 76 kcal/mol，如图1所示。通过计算亲和力也进一步验证21～43这段多肽的亲和力相当，而27～38这段多肽的亲和力较低，表明对接结果较好。

针对热点结合残基，设计一系列不同长度的多肽，并分别与RBD进行对接，如表2所示。结果显示30～38这段多肽是长度较短且对接结果相当的肽段。虽然它的亲和力只有-45.235 03 kcal/mol，但热点结合残基最为密集，且ZDock值也较大，说明这段多肽的形状互补性更好，更能与RBD紧密的结合。综上这段多肽具有较高的潜力并设定为初始肽段。

表2 多肽与RBD的对接结果

2.3 对初始肽段进行突变

对初始肽段首先进行单点突变(丙氨酸扫描)，来确定初始肽段中的关键氨基酸残基位点。其中32、33、37号位氨基酸残基突变为丙氨酸能量升高且超过0.5 kcal/mol，为关键氨基酸残基，30、34、38突变能升高小于0.5 kcal/mol，而31和35号位氨基酸残基突变能降低。故选择31、35以及36号位ALA氨基酸残基进行三点突变，共产生6 156种突变方式，其中共有3532种突变方式的突变能小于0.5 kcal/mol，最佳突变方式为K31I，E35Y，A36H。为更加方便的了解突变在整体上的情况，对突变能小于-4 kcal/mol的突变结果进行分析，如图2所示。

结果显示，这条多肽更倾向于突变成碱性残基，而在亲疏水性方面不太明显。这或许为设计新冠病毒的阻断剂做出了提示。将原始构象(pro1)，最佳前三种突变构象(pro2～pro4)以及最差突变构象(pro5)共五个构象与RBD的亲和力进行比较，如图3所示。发现亲和力和突变结果相符合，其中 pro2与RBD的结合力最高，pro2～pro4与RBD的结合力均在-100 kcal/mol以下，但pro4却表现出更高的范德华力。从结合能方面看，设计的肽段都要比RBD与ACE2的结合能高。使用DS软件的CDOCKER对接模块对这5条肽与RBD进行对接同时计算产生的每一个构象的结合能，如图4所示。结果显示pro4对接结果最好，pro5结果最差，这或许和范德华力的大小有关系。

图2 突变能小于0.5 kcal/mol的统计结果

图3 五条多肽与RBD的亲和力

图4 五条多肽与RBD的-CDOCKER能量值的统计结果

注：5条多肽(pro1、pro2、pro3、pro4、pro5)分别在5种浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)下对293-ACE2细胞的毒性。Relative survival/control=测试组OD值/对照组OD值，所有的点表示三个独立实验的平均值，误差线表示平均值的标准误差。图5 多肽细胞毒性分析

2.4 多肽细胞毒性分析

将对数生长期的293-ACE2细胞以3 000/孔接种于96孔培养板，实验每组设计4个复孔。37 ℃，5% CO2培养24 h。 每孔分别加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 的多肽，37 ℃，5% CO2培养48 h，MTT法测定不同多肽的细胞毒性。结果显示，不同浓度的多肽在293-ACE2细胞中均显示出较高的细胞活力(图5)，与对照相比无明显差异，因此推测5条多肽对细胞均无明显毒性。

2.5 多肽活性分析

将对数生长期的293T和293-ACE2细胞以5 000/孔接种于96孔培养板中，每组设计2个复孔，37 ℃，5% CO2培养24 h。将不同浓度的多肽与带有绿色荧光标记的新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus(GM-0220PV07)孵育10 min后加入细胞，高内涵成像分析系统结果显示，加入5条多肽后，与对照相比，进入细胞的病毒荧光强度明显减弱，并随多肽浓度的上升，荧光强度逐渐减弱(图6(a))，因此推测5条多肽均具有阻断病毒入侵细胞的能力。数据分析结果显示，pro1多肽和pro4多肽在最高浓度1 μM时的荧光强度最小，因此在该浓度下pro1和pro4阻断病毒入侵细胞的能力最强(图6(b))。

注：(a) 5条多肽(pro1、pro2、pro3、pro4、pro5)分别在4种浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)下对病毒的阻断作用;(b) 荧光强度的定量统计。相对荧光强度 Fluorescence relative to control =测试组荧光值/对照组荧光值，误差线表示平均值的标准误差。图6 多肽活性测定

3 讨论

由新冠病毒引起的疫情对人类的健康和世界的经济发展带来严重的破坏。S蛋白受体结合域(RBD)与血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合是新冠病毒进入宿主细胞的方式。ACE2表达于人体的多种器官和组织中，例如心脏、肾脏、睾丸、肺、肝脏、结肠、呼吸道以及血管[17]，因此ACE2在人体中扮演着极其重要的角色，这也是患者感染新冠病毒后，出现呼吸困难以及多种器官受损的原因所在[18]。阻断RBD与ACE2的结合，将会有效的抑制新冠病毒对人体细胞的感染。

本研究利用DS软件对接设计了一条含有9个氨基酸的多肽(pro1)，并通过突变进一步提高了其与RBD的亲和力(pro2-pro4)，从而阻断RBD与ACE2的结合。有研究表明，存在于hACE2上的一段多肽(a.a.21～43)与RBD的亲和力较高，且另一段多肽(a.a.27～38)不能与RBD结合[10]。对突变结果进行统计分析发现这条多肽更倾向于突变成碱性残基，而在亲疏水性方面不太明显，这为新冠病毒抑制剂的开发提供了重要依据。本研究进一步在体外细胞实验中证明计算机辅助设计的多肽具有一定的阻断病毒入侵的能力，与对接结果相似。pro5作为最差的突变体，与pro2、3的荧光强度相似，也具有一定的阻断病毒入侵的能力。这是因为原始肽段与RBD已具有较高的亲和力，虽突变结果较差但是仍然会表现出一定的亲和力。其次，设计的多肽的目的是为了和RBD-ACE2的结合面相结合，但也不排除设计的多肽会结合到其他位置，导致表现出了抑制作用，还需进一步验证。体外实验结果表明通过虚拟对接设计的多肽对病毒进入宿主细胞具有阻断作用，这种方法是可行的，但同时也表明虚拟对接设计与真实情况会存在一定的差别。计算机辅助药物设计在一定程度上缩短了药物筛选的时间，加快药物研发的速度，助力药物研究。