乌贼墨黑色素纳米粒对明胶-普鲁兰多糖复合膜的性能影响及表征

刘苏婷 宋诗军 方旭波 陈小娥,* 张海龙 马宇乔

(1 浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022；2 浙江国际海运职业技术学院，浙江 舟山 316021；3 舟山新诺佳生物工程有限公司，浙江 舟山 316000；4 浙江海洋大学石油化工与环境学院/临港石油天然气储运技术国家地方联合工程实验室，浙江 舟山 316022)

随着人们对食品安全和环保问题的日益重视，传统塑料包装所造成的环境污染引起了广泛关注，因此开发可降解、可食性的生物聚合物薄膜材料已成为食品包装领域的研究热点[1]。此类薄膜材料的成膜基质主要为蛋白质、脂类、多糖及这些生物聚合物的复合物[2]。其中，明胶是最常用的生物聚合物之一，其主要成分是蛋白质，具有良好的成膜性和生物相容性。明胶膜的机械性能较高，但其阻隔性能较差，因此需要与其他聚合物共混以提高其综合物理性能[3]。普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵产生的胞外线性多糖，该糖由重复的麦芽三糖单元聚合而成，水溶性及生物相容性好，以其为原料制备的膜具有良好的阻油性和阻氧性，但机械性能相对较差[4-5]。明胶与普鲁兰多糖间共混能改善单一组分膜的综合性能。如徐幸等[6]研究发现明胶与普鲁兰多糖分子间具有良好的相容性，两者共混制备的膜机械性能较高、水蒸气透过率(water vapor permeability，WVP)较低；高丹丹等[7]发现，在明胶膜中添加普鲁兰多糖能提高明胶膜的抗拉强度并改善其阻隔性能。

随着纳米技术的发展，纳米复合法也被广泛用于改善可食性膜的物化性能。近年来，天然纳米填料越来越受到国内外学者的关注。其中，乌贼墨黑色素是一种极具潜力的天然纳米填料，具有抗菌、防辐射等生物活性及可生物降解性，其抗氧化作用也已被国内外研究广泛证实[8-9]。乌贼墨黑色素的分子结构中存在许多反应性官能团(-OH、-NH和-COOH)，它们与聚合物基质之间的强氢键相互作用能改善聚合物的综合性能[10]。但未经处理的乌贼墨黑色素水溶性和粒径均匀性较差[11]。浙江海洋大学水产食品化学课题组前期采用高压微射流技术手段将乌贼墨黑色素制备成乌贼墨黑色素纳米粒(melanin nanoparticles，MNP)，发现不仅能使乌贼墨黑色素的粒径更小，还能有效改善黑色素的水溶性、粒径均匀性等物理特性，且在120 MPa高压微射流条件下制得的MNP平均粒径最小，为101.20 nm[12]。Roy等[13-14]在果胶/琼脂复合膜以及纳米纤维基复合膜中添加了MNP，发现所制备的复合膜不仅机械性能优良，还具有较强的抗氧化性和紫外阻隔性。目前，关于乌贼墨黑色素物化特性、生物活性的研究较多，但对于MNP对明胶-普鲁兰多糖(gelatin/pullulan，Gel/Pul)膜物化特性及抗氧化性能影响的研究尚鲜见报道。

本研究通过将高压微射流技术制备的MNP添加到Gel/Pul成膜基质中，评估MNP对Gel/Pul基复合膜物化特性的影响，探究不同MNP添加量对纳米复合膜的水蒸气透过率、透油率、机械强度、光学性能和抗氧化性能的影响，并通过扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)、傅立叶变换红外光谱(fourier transform infrared reflection, FTIR)对纳米复合膜进行表征，分析MNP与成膜基质间的相互作用，旨在为MNP应用于可食性包装膜研究提供理论和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻虎斑乌贼墨囊，陕西好时鲜海洋生物科技有限公司；普鲁兰多糖，河北鸿韬生物工程有限公司；碱性蛋白酶(200 000 U·g-1)，南宁庞博生物工程有限公司；鱼油，舟山新诺佳生物工程有限公司；明胶、甘油等均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

AMH-3高压微射流均质机，安拓思纳米技术(苏州)有限公司；JIDI-6 D低速大容量离心机，广州吉迪仪器有限公司；FA25-20DG均质机，上海弗鲁克科技发展有限公司；GJ-10冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；C-MAG HS 4磁力搅拌器，上海子期实验设备有限公司；HH-4 D数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；YNK/TH-100 L恒温恒湿试验箱，苏州优尼克环境试验设备有限公司；293-821-30数显外径千分尺，苏州量子仪器有限公司；UV-5900紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；XLW(B)电子万能拉伸实验机，济南蓝光机电技术有限公司；EM-30扫描电子显微镜，韩国COXEM有限公司；iCAN9傅里叶红外光谱仪，天津鹏普科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 MNP的制备 参照李萍等[12]的方法，从解冻好的乌贼墨囊中挤出乌贼墨汁，加入等体积去离子水浸泡过夜，8 000 r·min-1离心15 min，得到黑色素沉淀。以固液比1∶50(v/v)向沉淀中加入去离子水，调节pH值为10.5，加入4 200 U·g-1的碱性蛋白酶，50℃酶解4 h后于100℃沸水浴中灭酶活15 min。将酶解后的乌贼墨汁经120 MPa高压微射流处理制成纳米乌贼墨汁，冷冻干燥后即获得MNP。

1.3.2 乌贼墨纳米复合膜的制备 称取10 g明胶、4 g普鲁兰多糖和3 g甘油，加入300 mL去离子水，在90℃下磁力搅拌30 min，然后分别将不同添加量的MNP[0、0.5、1.0、1.5和2.0 wt%(占明胶和普鲁兰多糖总质量的百分比)]添加到上述溶液中，继续在90℃下磁力搅拌20 min。膜液置于真空脱气泵中脱气30 min后取40 mL均匀倒入玻璃培养皿中，于40℃下干燥过夜成膜。将剥离的膜在温度25℃和相对湿度50%下至少放置48 h，以确保在后续试验中样品水分正常化。每种浓度制备5个样品，用于后续试验。

1.3.3 膜厚度测定 用千分尺在每个膜样品上随机选取10个点，测定其厚度，取平均值，单位为μm。

1.3.4 水分含量 将10 mm×40 mm的膜置于105℃的鼓风干燥箱中干燥至恒重。按公式(1)计算膜的水分含量(moisture content，MC)：

MC=(m-m0)/m×100%

(1)

式中，m0为膜干燥前的质量，g；m为膜干燥后的质量，g。

1.3.5 WVP测定 将5 g干燥的无水氯化钙放入称量皿中，用薄膜样品覆盖皿口并密封，然后将称量皿置于含去离子水的干燥器中，每隔24 h，对称量皿进行称重，直至前后两次质量差不大于5%。按公式(2)计算WVP，单位为g·mm·m-2·h-1·kPa-1。

WVP=ΔM×t/(ΔP×S×ΔT)

(2)

式中，ΔM为称量皿的质量差，g；t为薄膜厚度，mm；S为薄膜的覆盖面积，m2；ΔT为时间间隔，h；ΔP为薄膜两侧的水蒸气压差，kPa，本试验取ΔP为3.167 kPa。

1.3.6 透油率测定 在试管中加入5 mL鱼油，用薄膜样品封口并倒置于滤纸上，于25℃、58%相对湿度的条件下，在干燥器中放置24 h，称量滤纸的质量变化。按公式(3)计算透油率，单位为g·mm·cm-2·d-1。

透油率=ΔW×t/(S×T)

(3)

式中，ΔW为滤纸质量差，g；t为薄膜厚度，mm；S为透油面积，cm2；T为放置时间，d。

1.3.7 透光率及不透明度 根据Hosseini等[15]的方法，将10 mm×40 mm 薄膜贴于比色皿一侧，以空白比色皿作为对照，测定薄膜在200～800 nm波长范围内的透光率，确定薄膜对光的阻隔性能；测定薄膜在600 nm波长处的透光率，按公式(4)计算膜的不透明度。不透明度值越大，膜的透明度越小。

不透明度=-lgT600/t

(4)

式中，T600为膜在600 nm处的透光率；t为薄膜厚度，mm。

1.3.8 机械性能 将薄膜切割成10 mm×50 mm的矩形条，使用电子万能拉伸实验机测定其抗拉强度(tensile strength，TS)和断裂伸长率(elongation at break，EB)，初始距离设为40 mm，测试速度设定为1 mm·s-1。

TS= F/S

(5)

EB=(L-L0)/L0×100%

(6)

式中，TS为抗拉强度，MPa；F为薄膜断裂时的最大拉力，N；S为薄膜的横截面面积，m2；EB为断裂伸长率，%；L0为薄膜的原始长度，mm；L为薄膜断裂时的长度，mm。

1.3.9 抗氧化活性的测定 将薄膜样品用去离子水复溶后制成20 mg·mL-1的薄膜样品溶液，进一步分析铁离子还原能力和DPPH自由基清除能力。

1.3.9.1 铁离子还原能力 根据赵岩岩等[16]的方法，将2 mL样品溶液与2 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol·L-1，pH值6.6)和2 mL铁氰化钾(1%，w/v)溶液混合，于50℃加热0.5 h，冷却后加入2 mL三氯乙酸溶液(10%，w/v)，混匀后以3 000 r·min-1离心10 min，取出2 mL上清液，加入2 mL去离子水和0.4 mL氯化铁溶液(0.1%，w/v)，充分混合。反应10 min后，以去离子水为参考，于700 nm处测定吸光度值(A700)。A700值越高，表明样品的铁离子还原能力越强。

1.3.9.2 DPPH自由基清除率 以95%乙醇为溶剂，配制DPPH溶液(10%，w/v)。将3 mL DPPH溶液与1 mL薄膜样品溶液充分混合，室温避光静置30 min，于517 nm处测定吸光度(A1)。再用95%乙醇分别代替上述体系中的样品溶液和DPPH溶液，作为对照组和空白组，测定对照吸光度(A2)和空白吸光度(A3)。按公式(7)计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%

(7)

1.3.10 FTIR分析 用傅里叶红外光谱仪(FTIR)分别采集MNP以及复合膜样品在550～4 000 cm-1范围内的FTIR图谱。复合膜的FTIR图在衰减全反射模式下采集，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1。

1.3.11 SEM观察 用扫描电子显微镜(SEM)在20 kV加速电压下观察复合膜的形貌。在SEM分析之前，使用真空溅射镀膜机对样品进行镀金。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 21.0和Origin 8.5软件进行数据统计分析，所有数据结果以平均值±标准差来表示，并使用方差分析(analysis of variance，ANOVA)对数据进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 MNP添加量对膜的厚度、WVP和MC的影响

由表1可知，未添加MNP的Gel/Pul膜的厚度为125.07 μm，随着MNP添加量的增加，纳米复合膜的厚度略有增加，最高达133.07 μm，这主要是复合薄膜中固体含量的增加所致。食品中的水分含量(MC)与其水分吸附能力密切相关，随着MNP添加量的增加，复合膜的MC逐渐降低，但相邻梯度间差异不显著(P>0.05)。当MNP添加量达到2.0 wt%时，纳米复合膜的MC从12.69%降至11.51%，显著低于纯Gel/Pul膜(P<0.05)。较低的MC一定程度上反映纳米粒与复合膜的亲水位点存在相互作用，从而减少与水的相互作用[17]。WVP是影响产品货架期的重要因素之一。降低膜的WVP能减缓食品与环境中水分交换速率，延长货架期[18]。Gel/Pul膜的WVP为0.305 g·mm·m-2·h-1·kPa-1，加入MNP后WVP呈先减小后增大的趋势，当MNP添加量为1.0 wt% 时，达到最低值0.281 g·mm·m-2·h-1·kPa-1，这表明添加适量的MNP有利于降低复合膜的WVP。

2.2 透油率

由表1可知，添加MNP后复合膜的透油率未发生变化，均为零。这可能是因为明胶和普鲁兰多糖具有亲水性，以此为基质制备的复合膜也展现出亲水性，而鱼油作为疏水性物质，与其不相溶，故油脂在复合膜中无法渗透[19]。综上，本研究制备的纳米复合膜具有良好的阻油性，可用于包装鱼油等高脂产品[20]。

表1 MNP添加量对Gel/Pul膜厚度、WVP和MC的影响

2.3 透光率及不透明度分析

薄膜的光学性质对其外观、应用以及销售影响较大。本研究评估了纳米复合薄膜的透光率及不透明度，结果如表2所示。未添加MNP时，在250～280 nm的紫外区，Gel/Pul膜的透光率在1.26%～5.30%范围内，在350～800 nm的可见光区，Gel/Pul膜的透光率在58.07%～91.30%范围内。添加MNP后，纳米复合膜的透光率随MNP添加量的增加而明显降低，表明MNP能增强复合膜的光阻隔性能，使复合膜具有优越的紫外阻隔性。薄膜的不透明度值越高，表明其透明度越低。随着MNP添加量的增加，复合膜的不透明度值逐渐增大，透明度呈现下降的趋势。

表2 MNP添加量对Gel/Pul膜透光率和不透明度的影响

2.4 机械性能

由图1可知，随着MNP添加量的增加，纳米复合膜的TS呈现先上升后下降的趋势。当MNP添加量为1.0 wt%时，纳米复合膜的TS达到最大值，与未添加MNP的复合膜相比显著增加了83.02%(P<0.05)。当MNP添加量超过1.0 wt%，纳米复合膜的TS反而持续降低，说明添加适量的MNP能够提高复合膜的TS，MNP对Gel/Pul膜具有一定的增强效果。另一方面，纳米复合薄膜的EB随MNP添加量的增加而略微降低，原因可能是MNP和成膜基质之间产生了氢键作用，促使拉伸阻力增大，导致复合膜的刚性增加、柔韧性降低。

注：不同小写字母表示同一指标不同MNP添加量之间差异显著(P<0.05)。下同。

2.5 抗氧化活性

由图2可知，未添加MNP的Gel/Pul膜也展现出抗氧化活性，这是因为明胶和普鲁兰多糖本身具有一定量的抗氧化活性[21-22]。随着MNP添加量从0增加到2.0 wt%，复合膜的抗氧化活性显著增强(P<0.05)，DPPH自由基清除率从10.22%增加到64.51%，铁离子还原能力从0.181 7增加到0.692 7；当复合膜中MNP的添加量达2.0 wt%时，两者均显示出最强的抗氧化活性。

图2 MNP添加量对Gel/Pul膜抗氧化活性的影响

2.6 FTIR光谱分析

由图3可知。未添加MNP的Gel/Pul膜中，3 278.39 和2 913.91 cm-1处的吸收峰分别对应于-OH、N-H的伸缩振动和明胶脂肪族侧链的C-H伸缩振动[23-24]。1 631.48 cm-1处典型的酰胺I区峰则与C=O拉伸振动有关，1 542 cm-1处的峰是酰胺II区N-H和C-N的伸缩振动[25]。1 238.08 cm-1附近的吸收峰为酰胺Ⅲ区C-N和N-H的伸缩振动峰[26]。这些吸收峰都是明胶和普鲁兰多糖吸收峰的叠加。在1 029.80 cm-1处的特征峰是甘油中-OH的伸缩振动[27]。加入1.0 wt%和2.0 wt% MNP后，未观察到明显的官能团变化，这表明MNP与Gel/Pul基质间未发生化学变化，但吸收峰的峰位和强度略有变化，是因为MNP与Gel/Pul基质间存在分子间氢键的相互作用[28]。

图3 MNP和纳米复合膜的FTIR光谱

2.7 SEM分析

为探究MNP在Gel/Pul基质中的分散状态，利用SEM观察了纳米复合膜的内部微观结构，如图4所示。在Gel/Pul膜中可以观察到表面整体平整，但存在少量褶皱，含MNP的纳米复合膜表面光滑连续，不存在纹路和裂隙，MNP均匀分布在Gel/Pul基质中，且没有出现分离的相，说明MNP与Gel/Pul基质具有良好的相容性。这一结果与其他学者制备的含MNP的复合膜SEM形貌类似[29-30]。究其原因，可能是MNP与Gel/Pul基质间相互作用形成氢键，形成了致密的网络结构，这与FTIR的研究结果一致。分子间的相互作用，宏观上可表现为机械性能上的改变，微观上则表现为复合膜微观结构的区别，这也解释了在MNP添加量为0 wt%～1.0 wt%范围内TS逐渐增大、WVP降低的原因[31]。此外，当MNP添加量增大到1.5 wt%，可观察到纳米粒的少量聚集，MNP添加量为2.0 wt%时，更多的纳米粒发生聚集，这也导致了水蒸气的扩散增强，与表1中WVP的变化趋势一致。

注：a～e：MNP添加量分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0 wt%。

3 讨论

WVP是判断复合膜对水蒸气等渗透物阻隔性能的重要指标之一。WVP越低越有利于延长食品贮藏期[32]。本研究发现，随着MNP添加量的增加，WVP呈先减小后增大的趋势，当MNP添加量为1.0 wt%时，WVP最低。究其原因，可能是由于在0～1.0 wt%的添加范围内，分散的MNP作为纳米填料，能够填补薄膜内的自由体积，使膜内部的孔隙率减少，形成曲折的扩散路径，阻碍了水分子的通过[33]。此外，MNP与聚合物基质相互作用形成了氢键，对WVP也有一定影响，因此WVP呈现下降趋势。当MNP添加量超过1.0 wt%时，WVP增大，这是因为MNP发生了颗粒聚集，纳米粒与聚合物基质界面处会形成微孔，导致薄膜结构中的空隙变大，使水蒸气在膜中的扩散路径不再曲折[34]，这与SEM观察结果一致。刘飞[35]在研究添加壳聚糖纳米粒对复合明胶膜的影响时也发现WVP具有类似的趋势。

另一方面，复合膜的光阻隔性能均随MNP添加量的增加而明显提高。这是因为分散在聚合物基质中的纳米粒通常具有光阻隔性能[36]，而MNP能够吸收大多数可见光、紫外光以及一些低能辐射，表现出优异的紫外阻隔性能。据Roy等[14]报道，MNP对纳米纤维素复合材料光学性能的影响与本研究结果相类似。由于紫外光会导致食品的劣变，尤其是脂质的氧化，因此复合膜紫外阻隔性能的提高能有效延缓脂质的氧化变质。

随着MNP的加入，复合膜的TS呈先增加后减小的趋势。这是由于MNP和Gel/Pul基质中的氢受体间存在氢键和范德华力，使得复合膜的结构更加致密，进而使TS增加。当MNP添加量继续提高时，TS的下降是由于过多的MNP在Gel/Pul膜中分散性变差，发生少量颗粒聚集，从而减少了聚合物基质与MNP之间的相互作用[37]。添加MNP后，复合膜的EB略有下降，Shankar等[28]研究也发现MNP的添加降低了明胶膜的EB。而Roy等[14]研究发现，随着MNP添加量的增加，纳米纤维素复合薄膜的EB先增加后减小，与本研究结果不一致，这一差异与黑色素纳米粒及成膜基质的种类和含量有关。由此可见，MNP与不同种类的成膜基质间可能存在不同的相互作用，有待进一步深入研究。

随着MNP添加量的增加，纳米复合膜的DPPH自由基清除率和铁离子还原能力均不断增大，表明MNP能显著(P<0.05)提高复合膜的抗氧化活性。Shankar等[28]在明胶基薄膜中添加1 wt% MNP后，发现薄膜的DPPH自由基清除率等抗氧化活性显著提高。Roy等[29]在卡拉胶基薄膜中添加MNP后也得出了类似的结果。这是因为MNP分子中的非共价电子很容易与自由基和其他活性物质相互作用，从而表现出较强的抗氧化能力[38]。另一方面，Moradi等[39]发现可食性薄膜的抗氧化能力与抗氧化活性成分的添加量成正比，因此MNP添加量越大，复合膜的抗氧化活性越高。

FTIR光谱图结果显示，添加MNP后，纳米复合膜特征吸收峰的峰位和强度略有变化，如3 278.39 cm-1处对应于-OH、N-H的伸缩振动峰强度有所降低且峰位略偏移，2 913.91 cm-1处对应于C-H的伸缩振动峰也发生了类似变化。Yang等[40]在海藻酸钠/聚乙烯醇复合膜中添加MNP后，发现复合膜的特征吸收峰峰位也发生了偏移，吸收峰的强度变弱，与本研究结果相类似。Roy等[14]研究MNP对壳聚糖膜FTIR图谱的影响时也观察到了类似的变化，同时指出，这是由于MNP与成膜基质之间存在分子间氢键的相互作用。

综上所述，添加MNP不仅可以提升Gel/Pul基复合膜的抗氧化活性和紫外阻隔性，而且可改善复合膜的机械性能和水蒸气阻隔性能。但本研究仅初步探究了MNP添加量对Gel/Pul复合膜结构和性能的影响，下一步还需重点研究复合膜在鱼油等高脂食品包装中的实际应用效果。

4 结论

本研究将高压微射流处理得到的MNP以不同的添加量添加到Gel/Pul成膜基质中，考察了复合膜的WVP、透油率、机械性能、光学性能、DPPH自由基清除率等指标，结果发现当MNP添加量为1.0 wt%时，复合膜具有最佳的机械性能和水蒸气阻隔性，同时复合膜也展现出优越的紫外阻隔性和抗氧化性能。综上，MNP能提高复合膜的物理性能和抗氧化特性，这对高脂和易氧化食品的贮藏保鲜及货架期的延长有积极意义。