电子束辐照对天麻粉灭菌效果及品质的影响

于 明 王 丹, * 王 钢 高 鹏 黄 敏 陈丽娟

(1 西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010；2 四川省原子能研究院，辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都 610101；3 成都默森辐源科技有限公司，四川 成都 610101)

天麻(Gastrodiaelata)是兰科天麻属天麻(GastrodiaelataBlume)的干燥块茎[1-3]，广泛分布于我国西南部和中部地区，有治疗头痛、降血压、镇静和抗炎等效用[4-5]。天麻含天麻素、对羟基苯甲醇、多糖、蛋白质等多种营养成分，且天麻素和对羟基苯甲醇作为《中华人民共和国药典》2020版规定测定的活性成分，是评价天麻品质的主要指标[6-7]。目前中华人民共和国国家卫生和健康委员会已将天麻纳入《按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点》中。天麻既可加工成天麻饮片、天麻复方颗粒，又可加工成降压咀嚼片和饮料等[8-9]。但由于天麻活性成分多、营养价值高，导致天麻表面微生物含量严重超标。传统的硫磺熏蒸和磷化铝熏蒸方法存在化学残留[10]等缺陷，气调贮藏成本高，热压灭菌会破坏天麻素成分[11]。因此，寻求新的灭菌贮藏方式是促进天麻产业发展的当务之急。

电子束辐照技术是一种绿色冷杀菌技术[12]，因杀虫灭菌效果显著、安全等受到广泛关注[13-14]。与传统硫熏灭菌方法相比，电子束辐照技术具有无污染、无残留等优点。与60Co-γ射线辐照灭菌方式相比，电子束辐照技术穿透能力较弱，具有单位时间内可加工产品量大、效率高、可控性强，且无环境污染隐患[15]等优势，已被广泛用于食品、药品及医疗用品的灭菌工艺中[16]，如蒸煮小龙虾[17]、冷鲜鸡[18]、葛根粉[19]等。

目前，电子束辐照在食品和中药材中的应用仍以灭菌杀虫为主，而有关电子束辐照处理对天麻色泽、活性成分含量及指纹图谱等品质影响方面的研究尚鲜见。本研究采用不同剂量0(CK)、5、7、9、11、13 kGy高能电子束辐照处理天麻，测定天麻的微生物数量、色泽、理化性质、活性成分含量及高效液相色谱(high performance liquid charamatography, HPLC)指纹图谱等指标，以期为电子束辐照技术在天麻灭菌加工中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天麻药材为市售，购自成都市国际商贸城中药材市场。

天麻素、对羟基苯甲醇、巴森利苷A(纯度均≥ 98%)，成都埃法生物科技有限公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯)，购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；胰酪大豆胨琼脂、沙氏葡萄糖琼脂，购于北京奥博星生物技术有限责任公司；重铬酸银剂量计，四川原子能研究院实验室自制。

1.2 仪器与设备

NH300电脑色差仪，深圳市三恩驰科技有限公司；KQ-250DB超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GH6000型隔水培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；HZQ-F全温振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；HH-S6数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；UltiMate3000DGLC双三元、二维液相色谱仪系统，美国赛默飞世尔公司；IS1020高能电子加速器，同方威视科技(北京)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辐照处理 将天麻样品粉碎(过50目筛)，用聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚乙烯(polyethylene glycol terephthalate/polyethylene, PET/PE)复合材料包装，每袋400 g，平均厚度约2 cm，送至重庆恒德辐照有限公司进行辐照处理，辐照吸收剂量分别设置为0(CK)、5、7、9、11、13 kGy。高能电子加速器参数为：电子束能量10 MeV，功率20 kW。采用四川原子能研究院自制的重铬酸银剂量计测定吸收剂量，实际测定吸收剂量为5.2、7.2、9.5、11.9、13.9 kGy。文中均以设定吸收剂量表示。

1.3.2 微生物限度指标测定 按《中华人民共和国药典》[2]2020版通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法测定天麻样品中的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数。

1.3.3 色差测定 天麻色泽测定参照武艳雪等[20]的方法。对仪器黑白版校正以后，取适量天麻样品置于粉末测试盒中进行测定，每个样品重复测定3次，记录其L*、a*、b*值。总色差ΔE由以下公式计算得出：

式中，ΔL*、Δa*、Δb*分别为剂量组与对照组L*、a*、b*的差值。

1.3.4 理化性质测定 按照《中华人民共和国药典》[2]2020版中的方法分别对天麻水分、醇溶性浸出物及总灰分含量等指标进行测定。

1.3.5 活性成分测定 参照《中华人民共和国药典》[2]2020版中的方法测定天麻素及对羟基苯甲醇总含量。

1.3.6 天麻HPLC指纹图谱测定

1.3.6.1 对照品溶液制备 取天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A对照品适量，精密称定0.01 mg，加10%的甲醇混合溶液制成每1 mL含天麻素25 μg、对羟基苯甲醇50 μg、巴利森苷A 50 μg的混合溶液。

1.3.6.2 供试品溶液制备[21-22]取天麻细粉2.0 g，置于150 mL具塞磨口锥形瓶中，加入50 mL 55%甲醇溶液，摇匀，称定重量，振荡器振摇2 min后超声(400 W，40 kHz)提取45 min，冷却放至室温，再次称定重量，用上述溶液补足失量，摇匀并过滤，取续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.3.6.3 高效液相色谱色谱条件 色谱柱：Hyersil GOLD(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液；按照表1进行梯度洗脱；波长：220 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃，进样量：10 μL。

表1 流动相时间程序

1.4 数据处理

采用Excel 2007对数据进行分析计算，SPSS 25软件Duncan’s多重检验法分析结果之间是否存在显著差异(P<0.05)，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 电子束辐照对天麻微生物数量的影响

天麻经电子束辐照后立即检测需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，结果见表2。天麻经电子束辐照后，其微生物数量明显减少。天麻的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数原始含菌量分别为 3.23×107、3.20×107(CFU·g-1)，经5 kGy剂量辐照后，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均减少了4个数量级；经7 kGy剂量辐照后，微生物含量降低了99.99%；经9 kGy剂量辐照后，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数含量均未检出，满足《中华人民共和国药典》[2]2020版规定。

表2 电子束辐照对天麻微生物总数的影响

2.2 电子束辐照处理对天麻色泽的影响

中药材色泽是影响药材经济价值的因素之一。用色差仪测定其L*、a*、b*与△E值，获得的数据可以判断电子束辐照对天麻色泽的影响，其中L*值表示明度，值越大，光泽度越好；a*值代表红绿值；b*值则代表黄蓝轴上颜色的饱和度。由表3可知，电子束辐照处理后天麻的色泽发生变化。不同吸收剂量电子束辐照处理后天麻的色度L*值分布在11.03～13.81之间。与对照组相比，辐照后的天麻L*值均降低，尤其是当辐照剂量为5、11、13 kGy时，其L*值显著低于对照组。a*值分布于22.74～26.33之间，表明颜色偏向红色，在13 kGy时达到最大值。b*值分布在32.03～35.18之间，均为正值，偏黄色。与对照组相比，各剂量组的b*值无显著差异，但5、7 kGy分别与13 kGy之间存在显著差异，且13 kGy时达最大值。总色差△E值在9 kGy时与对照组之间的差异最小，5 kGy的总色差则差异最大。

表3 电子束辐照对天麻色泽的影响

2.3 电子束辐照处理对天麻理化性质的影响

由表4可知，不同剂量电子束辐照处理对天麻的水分、总灰分含量无显著影响(P>0.05)。不同剂量电子束辐照处理天麻的醇溶性浸出物含量在16.90%～19.06%之间。与对照组相比，辐照处理后的天麻醇溶性浸出物含量略有上升，在9 kGy辐照时达到显著水平(P<0.05)。

表4 电子束辐照对天麻贮藏期内理化性质的影响

2.4 电子束辐照对天麻HPLC指纹图谱的影响

天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A对照品指纹图谱如图1所示。在天麻药材高效液相色谱(HPLC)指纹图谱上共选择标定了20个共有特征峰，与对照品指纹图谱比对，可确认6号峰为天麻素、7号峰为对羟基苯甲醇、15号峰为巴利森苷A。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0软件分别对不同剂量电子束辐照天麻的指纹图谱进行多点位校正、自动匹配，用中位数法生成对照图谱 R，即共有模式图，并计算相似度(表5)。以6号峰天麻素为参比峰，计算天麻活性成分特征峰的相对保留时间(表 6)。由表5和表6可知，6个辐照剂量下的天麻特征峰相似度均达到0.99，相对保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)均小于0.2%，说明在5～13 kGy吸收剂量范围内不会对天麻的化学成分一致性产生显著影响。

注：6：天麻素；7：对羟基苯甲醇；15：巴利森苷A。

注：R：对照图谱；S1：0 kGy；S2：5 kGy；S3：7 kGy；S4：9 kGy；S5：11 kGy；S6：13 kGy。下同。

表5 电子束辐照前后天麻药材指纹图谱相似度计算表

表6 电子束辐照对天麻指纹图谱相对保留时间的影响

2.5 电子束辐照处理对天麻活性成分含量的影响

为探究电子束辐照对天麻活性成分含量的影响，对电子束辐照处理后的天麻药材进行了活性成分定量检测，结果见表7。各辐照组与对照组间天麻素含量无显著差异，吸收剂量为5 kGy时，天麻素含量显著低于11 kGy吸收剂量组(P<0.05)；对羟基苯甲醇含量随着吸收剂量的增加而逐渐降低，在13 kGy时显著降低至最小值。尽管不同处理组间的天麻素、对羟基苯甲醇含量存在差异，但电子束辐照对天麻主要有效成分天麻素、对羟基苯甲醇总百分含量无显著影响(P>0.05)，表明天麻有效成分经5种剂量处理后无大幅度降解。

表7 电子束辐照对天麻活性成分的影响

3 讨论

3.1 电子束辐照对天麻微生物含量的影响

辐照直接或间接使微生物内的DNA双链断裂、蛋白质变性，从而使微生物丧失繁殖能力或死亡，且不会因温度升高而使热敏性物质发生破坏[11]。目前已有利用60Co-γ射线探究辐照天麻的灭菌效果的报道，而利用电子束辐照天麻灭菌的报道较为鲜见。本研究结果表明，电子束辐照能够有效降低天麻药材中需氧菌、霉菌和酵母菌数量以达到灭菌效果，且随着电子束吸收剂量的增加，对微生物的抑制作用逐渐增强，在辐照剂量为9 kGy时，天麻的微生物数量降至检测限以下，基本达到无菌水平。苏文俏[23]研究表明，采用辐照剂量为2、4、6 kGy的60Co-γ射线辐照天麻生药粉，能有效降低产品中细菌、霉菌及酵母菌的含量，其中6 kGy的60Co-γ射线辐照灭菌率能达到99%以上，与本研究中辐照能有效降低天麻中需氧菌、霉菌与酵母菌含量的结果一致。何毅等[24]研究表明，采用2 kGy电子束辐照处理即可在保证药材品质的前提下有效杀灭川产麦冬中的微生物，也说明电子束辐照能有效杀灭药材中的微生物。

3.2 电子束辐照对天麻色泽及理化性质的影响

中药材有其固有的色泽，是评价药材品质优劣最直观且重要的指标，它与中药材成分变化也有密切关系[25]。水分、灰分、浸出物含量是评价药材质量的指标。中药材水分含量过高不利于贮藏，容易滋生病虫和微生物，导致发霉、变质以及有效成分的减少，降低药效[26]。中药材灰分中的矿物质直接或间接地来自土壤，能反映药材中的金属矿物质水平。当总灰分含量控制在药典规定范围内则说明药材在种植、生产、运输和贮藏的各个环节中均无外界无机物的污染[27]。中药材浸出物作为药典规定的控制其品质的关键指标，具有保障中药材质量的作用。

本研究结果表明，电子束辐照对天麻亮度值有一定影响，即随着电子束吸收剂量的增大，天麻L*值降低。郭一丹等[28]研究发现60Co-γ射线和电子束处理使冬枣L*值降低，与本研究结果一致。有研究表明，总色差介于0～6之间时，色差不明显[24]，说明本研究中辐照对天麻总色差的影响较小，但总体呈现出随电子束吸收剂量增加先下降后上升的趋势，其中9 kGy辐照剂量对天麻总色差的影响最小。

本研究结果表明，电子束辐照处理对天麻药材中的水分和总灰分含量无显著影响。韩振明等[29]研究发现蜈蚣药粉中水分、总灰分、醇溶性浸出物含量在60Co-γ射线辐照前后均无显著差异，与本研究结果一致。电子束辐照在辐照过程中并不会引起温度的上升，因此对水分的影响较小。本研究结果表明天麻药材醇溶性浸出物含量随着吸收剂量的增加而增加。蔡汶莉[12]研究表明辐照后百合的水溶性浸出物含量显著上升，与本研究结果一致。这可能是由于电子束辐照引起了天麻药材中醇溶性生物大分子的降解，造成天麻醇溶性浸出物含量的上升。

3.3 电子束辐照对天麻HPLC指纹图谱的影响

研究者利用中药指纹图谱分析比对中药材的主要特征峰数量、峰面积或比例来达到对其质量的综合控制，保证中药材质量的稳定安全[30]。中药指纹图谱技术能在一定程度上反映电子束辐照前后天麻质量的变化。本研究结果表明，不同剂量电子束辐照处理并不会对天麻的HPLC指纹图谱产生明显影响，且各指纹图谱相似度均大于0.99，具有良好的相似性，不会对天麻化学成分的一致性产生明显影响。杨孝容等[31]研究发现天麻中某些化学成分会随着60Co-γ射线辐照剂量的增加而减少。邹琼[21]研究发现低于10 kGy剂量60Co-γ射线辐照天麻后指纹图谱相似度为0.918～0.999，结合5种成分含量变化情况后建议辐照天麻灭菌的剂量不超过6 kGy。以上研究均表明使用60Co-γ射线对天麻进行辐照灭菌时宜采用较低剂量，与本研究中13 kGy以内剂量辐照天麻不会对其成分产生明显影响的结果不一致，这可能与辐射源不同有关，但仍需进一步研究。

3.4 电子束辐照对天麻活性成分含量的影响

天麻素和对羟基苯甲醇是天麻的两种主要药用成分，也是评价天麻品质优劣的重要指标。天麻素具有催眠镇静、镇痛、防治再灌注损伤、降低血压、扩张血管等药理作用[32]。研究表明，对羟基苯甲醇作为天麻素的水解产物，同样也具有神经保护作用[33]。本研究发现，与对照组相比，各吸收剂量组天麻素含量均无显著差异。胥双等[34]研究发现天麻素含量在6 kGy的60Co-γ 射线辐照后无变化。陈艳[11]研究表明60Co-γ射线辐照对天麻素含量影响小。陈梅红等[35]研究发现4.20～8.40 kGy60Co-γ射线辐照不会破坏天麻素结构，其含量无显著变化。以上研究均表明较低辐照剂量的60Co-γ射线辐照处理不会影响天麻素含量，与本研究结果一致。说明天麻素结构在较低剂量辐照下较为稳定。张晓彬等[36]采用5～30 kGy的电子束和60Co-γ射线分别辐照天麻药材，结果表明天麻素含量随辐照剂量的增加而降低，这与本研究结果不一致，可能是由于高剂量60Co-γ 射线辐照致使天麻素分子中醚键断裂。杨孝容等[31]研究表明天麻素和对羟基苯甲醇在3～13 kGy60Co-γ射线辐照下相对稳定。这与本研究中对羟基苯甲醇的含量在辐照剂量为13 kGy时显著降低的结果不一致，但与辐射源是否有关还需进一步探讨。总体而言，电子束辐照处理对天麻药材中两者的总百分含量无显著影响。

4 结论

本研究结果表明，电子束辐照能有效降低天麻药材细粉中的微生物含量，且对其整体品质无显著影响。天麻中吸收剂量为9 kGy时，其微生物含量能满足《中华人民共和国药典》的规定，色泽变化最小，且有助于提高醇溶性浸出物含量，不会对天麻主要活性成分含量及化学成分一致性产生显著影响。