蚕豆发芽过程中蛋白质和抗氧化能力的变化

李程勋 徐晓俞 郑开斌 李爱萍

(福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013)

蚕豆，别名南豆、胡豆、兰花豆等，豆科、豌豆属，是主要的食用豆类作物[1-2]。蚕豆含有丰富的氨基酸、碳水化合物、纤维素、维生素、矿物质等营养成分[3-4]，具有高蛋白、高淀粉、低脂肪等特性[5-6]，其蛋白质含量比禾谷类作物小麦、稻米、玉米高2～3倍[7]。蚕豆蛋白中氨基酸种类丰富，含有人体所需的必需氨基酸，且蚕豆蛋白中只含有豆固醇，不含动物蛋白中的胆固醇，可以避免因摄入过多胆固醇而影响健康[8]，可见蚕豆是理想的蛋白来源[9-10]。埃及和摩洛哥将蚕豆作为蛋白质的重要来源，伊朗将蚕豆作为物美价廉的儿童高蛋白食品[11]。

近年来，发芽蚕豆作为一种营养食品受到人们的关注[12]。研究表明，发芽能够提高豆类的生理活性物质含量，如绿豆发芽能提高其酚类和膳食纤维类化合物含量，显著提高其营养价值[13-14]；大豆发芽可以提高其单糖、游离必需氨基酸[15]、有机酸[16-17]和功能因子含量[18-19]，产生新的活性物质[20]，降低致敏原和脲酶活性[21]，提高其抗氧化能力[22-23]；蚕豆发芽能提高总酚和L-二羟苯丙氨酸的含量[24]；发芽是改善豆类种子营养成分和降低抗营养因子的有效方法[24-25]。

当前对于蚕豆发芽方面的研究较少，且主要集中在发芽蚕豆蛋白质、脂肪、淀粉、抗营养因子、植酸等的含量测定方面[26-27]，对于发芽蚕豆的蛋白质变化趋势及抗氧化能力方面的研究尚鲜见报道。因此，本研究采用凯氏定氮法测定蚕豆发芽过程中蛋白质含量的变化，应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)技术观察蚕豆蛋白的变化趋势，并对蚕豆发芽过程中氨基酸的含量和成分变化进行观察和评估，应用自由基清除试验测定蚕豆蛋白的抗氧化能力，分析蚕豆发芽过程中蛋白质及其抗氧化能力的变化趋势，以期为蚕豆发芽产品的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

福蚕1号蚕豆种子，取自福建省农业科学院作物研究所。

1.2 试验仪器和试剂

DHG-9240A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；HK-04A手提式粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司；SB-5200DTDN超声仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge5804R离心机，德国Eppendorf公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

无水乙醇、氢氧化钠、过硫酸钾均为国产分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，东京化成工业株式会社；2,2′-联氮双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)ammonium salt, ABTS]，上海麦克林生化科技有限公司；1×磷酸盐(phosphate buffered saline, PBS)缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液、5×蛋白上样缓冲液[含二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)]，北京索莱宝科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发芽蚕豆样品制备 取蚕豆种子浸泡12 h，浸泡后取出用水冲洗，盖上湿布，在温度25℃条件下培育，每隔24 h进行取样，将发芽蚕豆样品置于烘箱中，75℃烘干至恒重，去皮研磨成细粉过100目筛，即得发芽蚕豆细粉。

1.3.2 蛋白质和氨基酸含量测定 采用《GB 5009.5-2016食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》的方法测定发芽蚕豆样品的蛋白质含量[28]；采用《GB 5009.124-2016食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》的方法测定发芽蚕豆样品的氨基酸含量[29]。

1.3.3 发芽蚕豆营养品质评价方法 采用联合国粮食与农业组织/世界卫生组织(Food and Agriculture Organization/World Health Organization, FAO/WHO)1973年推荐的全鸡蛋氨基酸模式和必需氨基酸模式，分别计算发芽蚕豆蛋白氨基酸评分(amino acid score, AAS)和化学评分(chemical score, CS)[30]。

1.3.4 蚕豆蛋白提取 参照杨海涛等[31]的试验方法。取适量发芽蚕豆细粉，以1∶5的料液比加入5×10-5mol·L-1的氢氧化钠(NaOH)溶液，震荡均匀，超声20 min，4 000 r·min-1离心10 min后取上清，加入氯化氢(HCl)调节上清液pH值至4.5，置于4℃冰箱中静置过夜，4 000 r·min-1离心10 min，用95%乙醇洗涤沉淀3次后干燥，即得蚕豆蛋白样品。

1.3.5 蚕豆蛋白SDS-PAGE凝胶电泳 利用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制胶，分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，用PBS溶液配置1 mg·mL-1蚕豆蛋白溶液，取10 μL蚕豆蛋白溶液与2.5 μL 5×蛋白上样缓冲液混匀，100℃水浴5 min，上样，电泳后用考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液进行染色，观察谱带并拍照。

1.3.6 蚕豆蛋白DPPH自由基清除能力测定 参照Baltrusaityte等[32]的试验方法。取蚕豆蛋白粉用PBS溶液配置成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1蚕豆蛋白溶液进行测定。

取蚕豆蛋白溶液和DPPH自由基溶液(39.40 μg·mL-1)等量混合均匀，静置30 min，测定混合液在517 nm波长下的吸光度，并按以下公式计算蚕豆蛋白溶液对DPPH自由基的清除率，每个样品重复3次。

DPPH自由基清除率=(1-A1/A2)×100%

式中，A1为DPPH自由基溶液与蚕豆蛋白溶液混合的吸光度值；A2为DPPH自由基溶液与纯水混合的吸光度值。

1.3.7 蚕豆蛋白ABTS自由基清除能力测定 参照管瑛等[33]的试验方法。取76 mg ABTS和13 mg过硫酸钾配置成20 mL的溶液，室温下暗室静置反应16 h，将溶液稀释50倍后待用。

取蚕豆蛋白溶液和ABTS自由基溶液混合均匀，静置30 min，测定混合液在734 nm波长下的吸光度值，并计算蚕豆蛋白溶液对ABTS自由基的清除率，每个样品重复3次。

ABTS自由基清除率=(1-A3/A4)×100%

式中，A3为ABTS自由基溶液与蚕豆蛋白溶液混合的吸光度值；A4为ABTS自由基溶液与纯水混合的吸光度值。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0软件进行数据分析，采用BandScan 5.0软件进行凝胶图像分析，采用GraphPad Prism 5软件作图。

2 结果与分析

2.1 蚕豆发芽过程中蛋白质的变化

由图1可知，蚕豆发芽后蚕豆蛋白的含量有显著升高，在发芽9 d时，蚕豆蛋白的含量达到最大值，为34.1 g·100g-1，比发芽0 d的蚕豆蛋白含量高25.4%。

注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

蚕豆蛋白中除了少量可溶于水的清蛋白外，大多数是盐溶性的球蛋白，清蛋白主要是功能蛋白，如糖苷酶和蛋白酶类等代谢过程中起重要作用的蛋白[34]，球蛋白主要是储藏蛋白，主要有11S球蛋白和7S球蛋白两种组分[35]，11S球蛋白存在4种酸性亚基和4种碱性亚基，它们之间的分子量相差很小，分别在34～45 kDa之间和17～20 kDa之间；7S球蛋白为三聚体蛋白，由3个分子量为68、72、52 kDa的亚基组成。由图2和图3可知，蚕豆蛋白SDS-PAGE凝胶电泳共检测出17条条带，相对分子量分别为116、97、96、72、68、64、63、56、52、47、42、40、38、32、27、22、17 kDa。随着蚕豆芽的生长，发芽蚕豆蛋白的分子量有变小的趋势，其中35 kDa以上的蛋白条带变淡，25～35 kDa和14.4～18.4 kDa之间的蛋白条带变深，可见在蚕豆芽生长的过程中，蚕豆蛋白部分由大分子量转变成小分子量。其中32 kDa处的蛋白表达量随着蚕豆发芽天数的增加而增大，32 kDa蛋白又称D1蛋白，是叶绿体psbA基因编码的位于类囊体膜上的一种蛋白质，是光合作用的调控位点[36-37]。

图2 蚕豆发芽过程中蛋白的SDS-PAGE图

图3 蚕豆发芽过程中蛋白变化

2.2 蚕豆发芽过程中氨基酸的变化

由表1可知，蚕豆发芽后氨基酸含量有一定的提升，随着蚕豆发芽天数的增加，氨基酸总量呈增加趋势，在发芽第9天时，氨基酸的总含量达到最大，为29.16 g·100g-1，比发芽0 d的蚕豆氨基酸含量高11.30%，其中天门冬氨酸的变化最为显著，在发芽9 d时达到最大值，为5.39 g·100g-1，比发芽0 d时的含量高76.14%。随着蚕豆发芽天数的增加，大部分氨基酸的含量都呈现出先上升后下降的趋势，胱氨酸和组氨酸在蚕豆发芽过程中变化较小。必需氨基酸总量占氨基酸总量(essential amino acid/total amino acids, ΣEAA/ΣAA)的比例随着蚕豆发芽天数的增加整体呈下降趋势，鲜味氨基酸总量占氨基酸总量(delicious amino acid/total amino acids, ΣDAA/ΣAA)的比例随蚕豆发芽天数的增加，呈上升趋势。由表2和表3可知，氨基酸评分(amino acid score, AAS)中除Met+Cys外，其他氨基酸的得分均大于或接近1，说明蚕豆蛋白的必需氨基酸含量丰富，营养价值较高，随着蚕豆发芽天数的增加，氨基酸AAS和化学评分(chemical score, CS)均有下降的趋势。综上，随着蚕豆发芽天数的增加，蚕豆氨基酸总量升高，必需氨基酸的比例下降，鲜味氨基酸的比例上升。

表1 蚕豆发芽过程中氨基酸的含量

表2 发芽蚕豆的氨基酸组成评价(AAS)

表3 发芽蚕豆的氨基酸组成评价(CS)

2.3 蚕豆发芽过程中蚕豆蛋白抗氧化能力的变化

2.3.1 蚕豆蛋白的DPPH自由基清除能力 由图4可知，蚕豆蛋白的DPPH自由基清除能力较弱，蚕豆蛋白浓度在0.5～2.5 mg·mL-1时，DPPH自由基清除能力均低于10%；在蚕豆发芽过程中，蚕豆蛋白的DPPH自由基清除能力有一定提升，在蚕豆发芽9 d时，蚕豆蛋白的DPPH自由基清除能力达到最大。

注：图中每个浓度内不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.3.2 蚕豆蛋白的ABTS自由基清除能力 由图5可知，蚕豆蛋白对ABTS自由基具有一定的清除能力，蚕豆蛋白浓度在0.5～1.5 mg·mL-1时，不同蚕豆发芽时间的蛋白ABTS自由基清除能力随蛋白浓度增加而增强，其中蚕豆发芽9 d的蚕豆蛋白在0.5～1.0 mg·mL-1浓度下，其ABTS自由基清除能力均比其他发芽时间的强；在蚕豆蛋白浓度为1.5 mg·mL-1时，蚕豆发芽9、10和11 d的蛋白ABTS自由基清除能力均达到最大值，清除率为99.53%；蚕豆蛋白浓度在2.0～2.5 mg·mL-1时，不同蚕豆发芽时间的蚕豆蛋白的ABTS自由基清除能力基本保持稳定，均达到最大值。

图5 蚕豆蛋白的ABTS自由基清除能力

3 讨论

3.1 蚕豆发芽过程中氨基酸、蛋白质含量的变化规律

蚕豆发芽后种子内储存的某些物质发生转化或含量提升，其中发芽后蚕豆蛋白质含量显著增加[38]。本研究结果表明，蚕豆发芽后，蚕豆蛋白和氨基酸含量有显著提升，主要是由于蚕豆发芽过程中，种子从休眠的静态转变成生理活动频繁的动态过程，种子内的酶活性增强，蚕豆蛋白、氨基酸含量增多，蚕豆蛋白由大分子量向小分子量转变[38]。另外，试验还发现蚕豆发芽过程中鲜味氨基酸天门冬氨酸的增加最为显著，说明发芽能增加蚕豆蛋白的鲜味，该结果与安广杰等[39]在大豆发芽过程中得出的结果一致。发芽过程中必需氨基酸含量的增加程度较小，必需氨基酸的AAS和CS评分下降，这可能是由于蚕豆发芽过程中蛋白质发生水解加上氨基酸转化形成的结果。

发芽过程是蚕豆蛋白不断分解和合成的过程，在发芽前期，部分高分子储藏蛋白分解转化成分子量较小的蛋白、肽和氨基酸[40]，使得蚕豆蛋白、氨基酸含量在前 9 d 有增加的趋势，到蚕豆发芽后期，蚕豆储藏蛋白减少，储藏蛋白的分解转化量亦减少，加上发芽对营养物质的消耗，使得发芽10 d后蚕豆蛋白和氨基酸含量有一定的下降。

本研究中，SDS-PAGE试验共检测出17条条带，相对分子量为17～116 kDa，这些蛋白的亚基与Warsame等[41]和刘珍珍等[42]的研究结果基本一致。35 kDa以上的蛋白条带变淡，25～35 kDa和14.4～18.4 kDa之间的蛋白条带变深，可见在蚕豆发芽过程中球蛋白含量减少，清蛋白含量增多，其中11S球蛋白的酸性亚基和7S球蛋白的亚基降解较快，11S球蛋白的碱性亚基降解较慢，这与安广杰等[39]在大豆发芽过程中得出的结果一致。蚕豆发芽过程中大分子量球蛋白含量减少，部分转化为多个小分子量的清蛋白，清蛋白含量增多，提高了蛋白的生物活性和营养价值。

3.2 蚕豆发芽过程中蚕豆蛋白抗氧化能力的变化规律

本研究提取的蚕豆蛋白具有较强的ABTS自由基清除能力，这可能是由于蚕豆蛋白中所含有的抗氧化肽组分具有良好的抗氧化作用。许庆鹏等[43]研究表明，豌豆蛋白肽具有较好的抗氧化作用，且豌豆蛋白肽分子质量越小的肽段抗氧化能力越好。崔素萍等[44]研究表明，芸豆蛋白抗氧化肽组分在大豆油氧化中具有一定的抗氧化作用，且分子量越低，抗氧化作用越强。大豆蛋白抗氧化肽组分、马铃薯蛋白抗氧化肽组分、乳清蛋白抗氧化肽组分等都被发现具有较好的抗氧化作用[44]。但蚕豆蛋白中起到抗氧化作用的抗氧化肽组分还有待进一步提取分析。

本研究发现，蚕豆蛋白对DPPH自由基的清除能力很弱，而对ABTS自由基有较强的清除能力，该结果与秦高一鑫等[45]在豌豆蛋白抗氧化试验中得出的结果一致，这可能是由于ABTS自由基比DPPH自由基更容易清除。发芽后蚕豆蛋白的ABTS自由基清除能力有一定提升，主要是因为蚕豆发芽后蛋白质含量提高，且小分子量的肽链占比增大，蛋白功效活性增强。

4 结论

本研究结果表明，蚕豆发芽可以促进蚕豆蛋白质的转化，增加蚕豆蛋白质、氨基酸含量，增强蚕豆蛋白的抗氧化能力，结果证实发芽可以改善豆类的营养成分，增强豆类的功效作用。本研究结果为发芽蚕豆的开发利用提供了参考依据，但此研究仅对发芽蚕豆蛋白的提取工艺进行了初步探讨，后续可通过对蚕豆发芽、蛋白提取等过程进行更深入的研究，建立一套适宜生产应用的发芽蚕豆蛋白提取工艺。