超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中硝基咪唑类药物及其代谢物

徐媛原，张 微，张 杨，李凯华，朱 颖，肖 曼，吴 丹，张 兵*

（1.深圳市质量安全检验检测研究院，深圳 518055；2.广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，深圳 518055）

硝基咪唑类药物作为抗生素和抗原虫药物，具有抗厌氧菌、广谱、杀菌作用强、价格低和疗效好等优点[1]，因此常被用于预防和治疗畜禽以及水产动物的滴虫病、球虫病[2]。在畜禽和水产养殖过程中，常见的硝基咪唑类药物主要为甲硝唑、地美硝唑和洛硝哒唑等，原药在生物体内代谢为羟基化合物，主要为羟基甲硝唑（甲硝唑代谢产物）和羟甲基甲硝咪唑（地美硝唑和洛硝哒唑代谢产物）。硝基咪唑及其代谢物具有潜在的致癌性和致突变等毒性作用，长期滥用药物后产生细菌耐药性[3]，易造成动物源性食品残留风险，因此欧美等发达国家已禁止在食源性动物中使用硝基咪唑类药物[4]。我国GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》明确规定，甲硝唑和地美硝唑允许用于治疗，不得在动物性食品中检出，农业农村部公告第250号规定洛硝哒唑在食品动物中禁止使用，不得检出。

目前，硝基咪唑类药物及其代谢物主要检测方法有酶联免疫法[5]、高效液相色谱法[6-7]、气相色谱-质谱联用法[8-9]和液相色谱-质谱联用法[10-15]等。我国也制定了一些相关检测标准，如GB/T 21318—2007《动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法》，这类检测方法前处理步骤繁杂，需多次提取、旋蒸、过柱等，消耗时间较多，且回收率偏低，不适宜大批量样品检测。本研究建立了简便、快捷和高效的水产品中硝基咪唑类药物及其代谢物的检测方法，可大幅缩短检测周期，节省人力物力成本，提高检测效率，适用于大批量的实际样品检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与标准品

乙腈、甲醇和甲酸（色谱纯），美国默克股份公司产品；超纯水，Milli-Q超纯水仪制得；固相萃取柱，Watses PRIME HLB 6 cc，200 mg。

分析标准品：甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑，纯度均大于99%，购于德国Dr.Ehrenstorfre公司。

1.2 试样准备

水产品的试样准备按照GB/T 30891—2014规定执行，鱼类取可食部分（肌肉和鱼皮）绞碎混合均匀后备用，虾类取可食部分（虾肉）绞碎混合均匀后备用，贝类将样品清洗后开壳剥离，收集全部的软组织和体液匀浆后备用，于-18℃冷冻避光保存。实际样品源自深圳市农贸市场、商超和电商等。

1.3 标准溶液配制

分别准确称取10.0 mg按纯度折算100%质量的甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑的标准物质，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制浓度为1 000 μg·mL-1的标准储备液，4℃冰箱避光保存。分别吸取上述标准储备液1.00 mL用甲醇定容至10.0 mL，配制浓度为100 μg·mL-1的混合标准储备液，逐级稀释成10.0 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1的混合标准工作液，4℃冰箱避光保存。

1.4 仪器设备

Agilent 1290Ⅱ超高效液相色谱串联AB SCIEX三重四级杆5500质谱仪配备电喷雾离子源，美国Agilent科技有限公司和美国SCIEX公司产品；梅特勒PL602E电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；奥盛MTV-100自动试管振荡器，杭州奥盛仪器有限公司产品；Sigma 3-30KS高速离心机，德国Sigma公司产品；N-EVAP-24型全自动氮吹仪，美国Organomation公司产品；Supelco visiprep SPE 24-port model固相萃取装置，德国默克公司产品。

1.5 检测方法

准确称取2.50 g（精确到0.01 g）均质试样于50 mL具盖离心管内，准确加入10 mL 80%乙腈水提取液（含0.2%甲酸），2 500 r·min-1涡旋振荡5 min，9 000 r·min-1离心5 min。吸取3.5 mL上清液直接过Watses PRIME HLB固相萃取柱，调整过柱速度，以1滴·s-1速度过柱，收集滤液于离心管中。准确吸取滤液2.5～5.0 mL带刻度离心管内，在40℃水浴下氮气吹至滤液少于0.5 mL，用10%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）将残留液定容至1.00 mL，2 000 r·min-1涡旋振荡溶解残留物1 min，溶解后的残留物通过0.22 μm滤膜，液相色谱-质谱上机测定。

1.6 仪器条件

1.6.1 液相色谱条件

色谱柱：BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A为1%甲酸水溶液，B为甲醇；柱温：40℃；进样量：5.00 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.6.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测模式（MRM）；电喷雾电压：5.5 kV；离子源温度：550℃；气帘气压力：35 psi；碰撞气压力：9 psi；喷雾气压力：55 psi；辅助加热气压力：55 psi。以定性定量离子的丰度比和保留时间定性，以峰面积定量。硝基咪唑类及其代谢物的质谱参数见表2。硝基咪唑类及其代谢物的混合标准溶液MRM色谱图见图1。

表2 硝基咪唑类及其代谢物质谱参数

图1 混合标准溶液MRM色谱图

1.7 标准曲线

取不含待测物的空白鱼肉样品，分别添加硝基咪唑类及其代谢物（甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑）混合标准溶液，制得浓度为1.00、2.00、5.00、10.0和20.0 μg·kg-1的系列加标样品，上述样品按照1.5中的方法进行前处理，高效液相色谱串联质谱测定，以硝基咪唑类及其代谢物各化合物色谱峰面积为纵坐标，各化合物的添加浓度为横坐标建立标准曲线。

1.8 加标回收率测定

分别向罗非鱼、基围虾和花甲不含待测物的空白试样中添加25 μL、75 μL浓度为100 μg·L-1混合标准工作溶液，25 μL浓度为1.00 μg·mL-1混合标准工作溶液进行1.00、3.00和10.0 μg·kg-13个浓度水平的阳性添加回收率测定，每个浓度水平平行测定6个样品，所有试样均按照1.5中的方法处理，分别计算甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑的检出限、精密度和回收率。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

以硝基咪唑类及其代谢物各化合物的特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，添加浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见表3，可知在1.00～20.0 μg·kg-1线性范围内，甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑的相关系数分别为r=0.999 3、r=0.999 7、r=0.999 4、r=0.999 4和r=0.999 5，各化合物特征离子质量色谱峰面积与相应加标回收浓度的线性关系良好。

表3 硝基咪唑类及其代谢物线性特征参数及检出限

2.2 方法检出限

以空白鱼肉为基质，以最低添加浓度进行检验，根据GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》确定检出限的方法，采用信噪比法评估检出限，根据3倍信噪比确定该方法各项目的检出限见表3，甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑的检出限分别为0.211、0.191、0.123、0.137和0.266 μg·kg-1，表明该方法灵敏度较高。

2.3 回收率和精密度

本研究以空白罗非鱼、基围虾和花甲为基质，按照1.5中的前处理方法分别对甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑进行1.00、3.00和10.0 μg·kg-13个浓度水平的回收率测定，每个浓度水平平行测定6个样品，计算出各物质不同浓度水平的回收率及相对标准偏差，结果见表4。

表4 加标回收率和相对标准偏差（n=6）

由表4可知，该方法的回收率、精密度良好，在3个不同加标浓度水平下，甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑的回收率范围分别为85.9%～106.0%、85.7%～106.1%、87.1%～105.6%、87.4%～105.4%、96.3%～106.2%，相对标准偏差范围分别为3.2%～7.0%、3.9%～6.7%、3.7%～5.3%、3.6%～6.6%和3.4%～8.9%，各基质各项目均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求以及国标方法对该类物质的检测分析要求。表明该方法精密度、灵敏度更高，检出限低，适用于水产品中硝基咪唑类药物及其代谢物的测定。

2.4 实际样品检测

将本研究建立的方法应用于检测水产品中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量。实际样品采样于深圳市农贸市场、商超和电商等。采集品种主要包括草鱼、福寿鱼、鲈鱼、基围虾和花甲等鲜活水产品，采集数量共计10份。检测结果显示，在实际样品中未检测出硝基咪唑类药物及其代谢物。

3 结论

本研究方法建立了水产品中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。该方法采用少量试剂提取，Watses PRIME HLB固相萃取柱净化，与传统的方法相比，无需消耗大量有机试剂，采用通过式固相萃取方式，无需进行活化、淋洗、洗脱等繁琐步骤，极大地减少了试剂消耗，缩短了检测时间，提高了检测效率。本方法通过多种水产品基质验证，结果表明前处理过程简便和快捷，不仅极大缩短了检测时间，提高了检测效率，且该方法检出限更低、精密度更高、定性定量更准确，适用于水产品中甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑、羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑的残留量检测。