重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗对白羽肉鸡免疫效果研究

孙 心，李叔伟

（1.哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150040；2.齐齐哈尔大学，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

由H5和H7亚型禽流感病毒（AIV）引起的高致病性禽流感（HPAI）已被世界动物卫生组织列为一类动物疫病[1]。近年来，由于我国家禽养殖密度过大，生物安全措施不到位，防控意识不到位，从而造成了高致病性禽流感病毒频频出现变异，增加了防控难度。2021年高致病性禽流感发生率升高，H5亚型2.3.4.4d分支是目前影响我国部分地区养禽业的主要AIV，以2.3.4.4d分支为代表的是H5N6亚型。同时，目前禽流感H5N8亚型已在全球广泛传播，在欧洲国家以及美国均已检出[2-4]，现在也严重危害我国养禽业。近年我国白羽肉鸡鸡群也开始发生高致病性禽流感，发生日龄多在30日龄以后，因母源抗体无法保护21日龄之后的鸡群，白羽肉鸡免疫高致病性禽流感疫苗是一个趋势，尤其在秋冬季节免疫是必要的。本试验应用重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株和H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株）进行免疫监测，以掌握该疫苗的免疫效果，为今后高致病性禽流感疫苗在白羽肉鸡上的应用提供数据。

1 材料

1.1 疫苗及试剂

重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株灭活疫苗，哈药集团生物疫苗有限公司生产。

禽流感H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株以及H7N9 Re-4株抗原及阳性血清，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；红细胞悬液（SPF级公鸡红血球），购自哈药集团生物疫苗有限公司。

1.2 试验动物

1日龄白羽肉鸡3 300羽，平均体重50 g·羽-1，黑龙江省哈尔滨市某白羽肉鸡养殖场提供，其中正常免疫鸡群3 000羽，应激试验用300羽。

2 方法

2.1 鸡群抗体检测试验

3 000羽试验鸡随机分为A、B、C、D 4组，每组750羽。A、B组在雏鸡1日龄时分别接种重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），免疫剂量分别是0.15 mL·羽-1和0.30 mL·羽-1；C、D组在雏鸡7日龄时分别接种重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），免疫剂量分别是0.30mL·羽-1和0.50mL·羽-1。鸡群在同一管理条件下进行饲养。

A、B组雏鸡在1日龄接种重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗前随机抽取20羽，心脏采血，检测母源抗体；分别在7、14、21、28、35、42日龄各组随机20羽鸡翅静脉采血，离心制备血清，按照现行《中国兽药典》附录红细胞血凝抑制试验（HI）进行抗体效价检测。C和D组雏鸡7日龄接种疫苗，分别在7、14、21、28、35和42日龄各组随机取20羽鸡翅静脉采血，离心制备血清，按照现行《中国兽药典》附录红细胞血凝抑制试验（HI）进行抗体效价检测。待检血清HI抗体效价≥4 lb为抗体合格。

2.2 应激试验

300羽雏鸡随机分为A、B、C、D 4组，每组75羽，分别于不同日龄（1日龄、7日龄、1日龄、7日龄）接种不同剂量（0.15 mL、0.30 mL、0.30 mL、0.50 mL）的重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），接种后观察疫苗吸收时间及试验鸡的精神状态、采食量，判断该疫苗对鸡群的应激情况。

3 结果与分析

3.1 重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗接种后的抗体消长规律

3.1.1 1日龄接种0.15 mL·羽-1

1日龄接种0.15 mL·羽-1疫苗后检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表1和图1。

表1 试验鸡1日龄接种0.15 mL·羽-1后各日龄的抗体效价 lb

图1 试验鸡1日龄接种0.15 mL·羽-1后各日龄的抗体效价

1日龄白羽肉鸡接种0.15 mL·羽-1H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果显示H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在14日龄时达到4.8 lb、5.1 lb和5.1 lb，在42日龄分别达到7.2 lb、7.3 lb和7.2 lb。从结果看三价灭活疫苗1日龄免疫0.15 mL·羽-1后，可以保证白羽肉鸡出栏时（42日龄左右）具有足够的H5和H7抗体水平。

3.1.2 1日龄接种0.30 mL·羽-1

1日龄接种0.30 mL·羽-1疫苗后检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表2和图2。1日龄白羽肉鸡接种0.30 mL·羽-1H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在14日龄时分别为4.7 lb、5.1 lb和5.1 lb，在42日龄时分别为7.3 lb、7.3 lb和7.2 lb。从结果看三价灭活疫苗1日龄免疫0.30 mL·羽-1后，可以保证白羽肉鸡出栏时（42日龄左右）具有足够的H5和H7抗体水平。

表2 试验鸡1日龄接种0.30 mL·羽-1后各日龄的抗体效价lb

图2 试验鸡1日龄接种0.30 mL·羽-1后各日龄的抗体效价

3.1.3 7日龄接种0.30 mL·羽-1

7日龄接种0.30 mL·羽-1疫苗后检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表3和图3。7日龄白羽肉鸡接种0.30 mL·羽-1H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在21日龄时分别为4.9 lb、4.8 lb和4.4 lb，在42日龄时分别为6.4 lb、6.6 lb和6.1 lb。从结果看三价灭活疫苗7日龄免疫0.30 mL·羽-1后，可以保证白羽肉鸡出栏时（42日龄左右）具有足够的H5和H7抗体水平。

图3 试验鸡7日龄接种0.30 mL·羽-1后各日龄的抗体效价

表3 试验鸡7日龄接种0.30 mL·羽-1后各日龄的抗体效价lb

3.1.4 7日龄接种0.50 mL·羽-1

7日龄接种0.50 mL·羽-1疫苗后检测试验鸡不同日龄的抗体效价，结果见表4和图4。7日龄白羽肉鸡接种0.50 mL·羽-1H5+H7亚型三价灭活疫苗，监测结果H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株、H7N9 Re-4株抗体效价在21日龄时分别为5.0 lb、4.8 lb和4.4 lb，在42日龄时分别为6.5 lb、6.7 lb和6.2 lb。从结果看三价灭活疫苗7日龄免疫0.50 mL·羽-1后，可以保证白羽肉鸡出栏时（42日龄左右）具有足够的H5和H7抗体水平。

图4 试验鸡7日龄接种0.50 mL·羽-1后各日龄的抗体效价

表4 试验鸡7日龄接种0.50 mL·羽-1后各日龄的抗体效价 lb

3.2 不同日龄白羽肉鸡接种重组禽流感H5+H7亚型三价灭活疫苗的应激反应

试验鸡应激反应情况见表5。

表5 不同日龄白羽肉鸡接种重组禽流感H5+H7亚型三价灭活疫苗的应激反应

1日龄和7日龄白羽肉鸡鸡群接种不同剂量的重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），从完全吸收时间、精神状态和采食量方面来评价接种疫苗后鸡群的应激状况，结果表明接种最大剂量0.50 mL·羽-1时，疫苗对鸡群应激影响是一过性的，1～2 d可以恢复。通过本试验可以得出1日龄接种0.15 mL·羽-1H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群没有应激反应，7日龄接种0.30 mL·羽-1H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群没有应激反应。但在实际应用中，接种疫苗时鸡群会受到饲养环境的影响，偶有鸡只会出现一过性应激反应。

4 讨论

4.1 免疫日龄选择

近几年高致病性禽流感在白羽肉鸡鸡群中的发生率持续增高，以往白羽肉鸡由于生长周期短的原因，不接种重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗，往往依靠母源抗体来预防高致病性禽流感的侵袭，但母源抗体对于白羽肉鸡只能保护到21日龄左右，而近两年白羽肉鸡发生高致病性禽流感多集中在30日龄以后，所以接种高致病性禽流感疫苗是目前有效预防白羽肉鸡发生高致病性禽流感唯一有效方法，接种日龄是尤为关键的。目前白羽肉鸡7日龄接种重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗是比较常见的，但是对于白羽肉鸡的保护率有待进一步评估。我国早期使用的重组禽流感病毒H5+H7亚型二价灭活疫苗，在广西就应用在白羽肉鸡鸡群中，免疫日龄为1日龄，从抗体监测结果看，免疫效果较为理想。白羽肉鸡在现地疫苗免疫预防时，有些地区和省份，新城疫+H9二联灭活疫苗、新城疫+H9+鸡传染性支气管+鸡传染性法氏囊四联灭活疫苗习惯在1日龄接种，所以白羽肉鸡1日龄不接种重组禽流感病毒H5+H7亚型疫苗。正常在1日龄免疫灭活疫苗是十分谨慎的，因为雏鸡有母源抗体的保护，所以容易造成母源抗体的干扰。本试验选取1日龄和7日龄白羽肉鸡分别接种重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗（H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株+H7N9 Re-4株），并在7、14、21、28、35和42日龄进行抗体监测，结果表明1日龄和7日龄接种高致病性禽流三价灭活疫苗在21日龄后监测抗体效价，21、28、35和42日龄H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株和H7N9 Re-4株抗体效价，1日龄接种要高于7日龄接种的抗体效价，证明1日龄接种重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗受到母源抗体的干扰很低，而且从母源抗体降低后，在21日龄左右疫苗产生的抗体效价在4 lb以上，所以从白羽肉鸡雏鸡出壳到出栏，H5N6 Re-13株、H5N8 Re-14株和H7N9 Re-4株抗体效价都在4 lb以上，对于白羽肉鸡整个生长周期都有保护力。

4.2 免疫剂量选择

试验在1日龄白羽肉鸡接种0.15 mL·羽-1、0.30 mL·羽-1重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗，7日龄白羽肉鸡接种0.30 mL·羽-1、0.50 mL·羽-1重组禽流感病毒H5+H7亚型三价灭活疫苗，从完全吸收时间、精神状态和采食量方面来评价接种疫苗后对鸡群应激状况，1日龄接种最大剂量0.30 mL·羽-1、7日龄接种最大剂量0.50 mL·羽-1时，疫苗对鸡群应激影响是一过性的，1～2 d可以恢复。通过本试验可以得出1日龄接种0.15 mL H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群没有应激反应，7日龄接种0.30 mL·羽-1H5+H7亚型三价灭活疫苗对鸡群没有应激反应。综合比较1日龄和7日龄接种不同剂量H5+H7亚型三价灭活疫苗后抗体效价，1日龄接种0.15 mL·羽-1和0.30 mL·羽-1产生的抗体效价无明显差异，7日龄接种0.30 mL·羽-1和0.50 mL·羽-1产生的抗体效价无明显差异，选择最佳接种剂量为1日龄接种0.15 mL·羽-1，7日龄接种0.3 mL·羽-1。