曹恺欣, 武俊瑞, 李煜, 韩琦, 于博, 祁姝旖, 乌日娜, 芒来
(1.沈阳农业大学食品学院, 沈阳 110866;2.辽宁省食品发酵技术工程研究中心, 沈阳 110866;3.沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室, 沈阳 110866;4.内蒙古农业大学动物科学学院, 呼和浩特 010018)
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种严重威胁健康的疾病, 其传播和发展的速度较快。19世纪的中叶, 有部分欧美国家利用异烟肼、利福平等抗生素治疗结核病, 效果显著[1]。然而抗生素虽具有抑菌或杀菌作用, 但长期用药会使人体正常菌群系统紊乱, 产生耐药性。因此, 寻找一种治疗结核病的绿色疗法逐渐成为趋势。
酸马奶(Koumiss)是一种古老的食疗饮品, 具有养肺、清热解毒、缓解咳嗽、抑制腐败菌等优良特性[2]。临床经验表明, 酸马奶对结核分枝杆菌有特异性免疫作用[3-4], 是辅助治疗结核病最理想的天然药物之一, 具有广阔的医疗应用前景。但其作用机理尚不明确, 本文主要从酸马奶微生物间的相互作用总结酸马奶治疗结核病的研究进展并对其机理进行探索。
酸马奶又称马奶酒、策格, 在中亚地区也被称为qymyz, 营养价值丰富。早在公元前5世纪, 古希腊历史学家希罗多德(Herodotus, 约前425~484年)就记载了塞西亚人制作和饮用酸马奶[5]。在我国, 酸马奶早在匈奴时期开始饮用[6], 因其富含多种对身体有益的成分, 能够提高机体免疫力, 成为蒙医的一种传统疗法。
如图1所示, 酸马奶是以新鲜马乳为原材料, 经乳酸菌和酵母菌等微生物共同发酵而成, 富含蛋白质、脂肪、乳糖、维生素及矿物质等多种营养物质。与其他动物乳相比, 马乳营养含量更高, 营养成分与人乳最为接近, 是人类母乳的最佳替代品[7]。马乳蛋白质是营养学上的完全蛋白质, 含有人体必需的9种氨基酸[5], 其含量约占总氨基酸的43 %;并且具有低胆固醇含量、低脂肪含量、高多不饱和脂肪酸含量的特点, 更有益于人体健康[8-9]。马乳发酵制成的酸马奶中的蛋白质含量约在2 %, 其中酪蛋白与乳清蛋白比例接近于1∶1, 与牛乳相比, 含有更多的必需氨基酸;脂肪含量约为2 %, 不饱和脂肪酸种类丰富, 其中人体必需的亚油酸、亚麻酸含量较高[3-6]。酸马奶中含有磷、钙、铜、铁、锌等较丰富的矿物质, 以及大量丰富的维生素A、维生素B1、B2、B12、维生素C、D、E, 其中维生素C的含量极高;虽然酸马奶中钙的含量较低, 但钙磷比例适宜, 利于人体吸收和消化[5-9]。
图1 酸马奶中的营养成分
早在两千多年以前, 《汉书·礼乐志》就记述了游牧民族饮用酸马奶的习俗;到蒙元时代, 酸马奶成为元朝宫廷和蒙古贵族府第的主要饮品, 并享有“塞北八珍”的美誉。长期饮用酸马奶有助于消化, 能够调节肠道健康菌群的平衡、抑制有害微生物的生长繁殖、消除肠道内有害物质, 从而改善机体的健康状态[10]。酸马奶中所含丰富的营养物质, 有参与人体新陈代谢、降低血液中胆固醇水平、抗高血压、提高人体免疫力及防治疾病的功效[11]。对动脉硬化、冠心病、高血压心血管疾病、结核病以及坏血病等均有良好的治疗效果[3-8]。蒙古民族在长期的迁徙游牧的生活过程中, 通过纯天然防病、治病的经验, 形成了“酸马奶疗法”[12]。近年来内蒙古、蒙古和俄罗斯等地区纷纷建立起“酸马奶医疗中心”, 专门用于治疗心血管系统疾病[5]、慢性萎缩性胃炎、肺结核、肠结核等消化系统疾病和慢性消耗性疾病[13-15];蒙古用于治疗结核病的酸马奶已进入临床试验阶段[8]。
酸马奶制品中微生物种类丰富, 是一个复杂的微生态环境。其中益生菌主要指乳酸菌和酵母菌[16];除此之外, 还包括有明串球菌、醋酸菌、肠球菌等其它种类微生物[17]。在发酵过程中, 由于酵母菌和乳酸菌的作用使得酸马奶的酸碱度降低, 不利于腐败细菌和其他微生物的生长, 从而具有抗菌特性。酸马奶中益生菌代谢产生的细菌素、有机酸等成分对结核分枝杆菌具有较强的抗菌活性。
自2000年开始, 酸马奶得到了我国食品科研工作者的重视, 对其开展菌种筛选和微生物多样性分析等诸多研究[18], 各种测序技术的发展也为传统酿造食品中复杂微生物群的研究奠定了基础。姚国强[19]等人利用单分子实时测序技术系统分析了酸马奶样品的细菌多样性。结果表明, 单分子实时测序技术可以大大提高细菌多样性检测的准确性和灵敏度, 特别是低丰度菌群。在蒙古国传统酸马奶中乳酸菌多样性的研究中, 刘文俊[20]等人采用的PacBio三代测序技术(PacBio SMRT), 可通过其特有的CCS测序模式对同一条序列多次重复测序的结果进行校正, 从而获得测序高质量的一致性序列。Xia[21]等人利用UPLCQ-TOF-MS的代谢组学方法确定了酸马奶发酵过程中的7个关键代谢途径。
受地域、自然环境、季节、制作方法、发酵时段等多种因素影响, 即使是同一地区的酸马奶样品, 其微生物组成和数量也会有所差别。Tang[22]等人在14份酸马奶酒样品中, 共鉴定出119种细菌和36种酵母菌, 城市和农村的样品间存在差异。宋凯[23]利用Illumina Miseq高通量测序对传统酸马奶的细菌多样性进行分析。结果表明, 其优势细菌门为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)与Wurihan[24]等人的研究略有差别。使用Illumina miseQ平台调查发现酸马奶发酵过程中产生的连续细菌群落, 主要细菌种类是海尔维氏乳杆菌、parauberis链球菌(phylum Firmicutes)和巴氏醋杆菌(phylum Proteobacteria)。Meng[25]等人基于高通量测序(HTS)的微生物分析表明, 乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、醋杆菌(Acetobacter)、链球菌(Streptococcus)、沙雷氏菌(Serratia)和明串珠菌(Leuconostoc)以及哈萨克斯坦菌属(Kazachstania)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、丝孢酵母科(Trichosporonaceae)、毕赤酵母(Pichia)和假丝酵母(Candida)是传统发酵过程中的优势属。在人工酸马奶酒中, Guo[26]等人的研究证明了乳酸菌和酵母菌是优势菌属。Khrisanfova[27]等对酸马奶酒的微生物群进行研究发现, 酸马奶酒的乳酸酵母与酸马奶酒的酒精发酵有关, 能够生成2%~3.5%的乙醇, 并且它们均有产生抗生素的能力, 是酸马奶酒具有抗生素活性的主要原因之一[11]。
酸马奶的抑菌作用与其中的乳酸菌密切相关[28]。一方面, 酸马奶中大量存在的乳酸菌本身具有占位性优势, 与有害菌有营养竞争作用;另一方面, 乳酸菌产生的细菌素等物质抑菌物质具有广谱抑菌作用, 能够很好的抑制革兰氏阳性菌, 对部分革兰氏阴性菌也有抑制作用[25]。姜晶[29]等人从酸马奶中提取得到的植物乳杆菌DSM20174细菌素有较好的抑菌作用, 且pH越小时, 其抑菌活性越强。满丽莉[28]等人研究发现, 一株内蒙古酸马奶来源的植物乳杆菌MXG-68所产细菌素能抑制包括鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等在内的20株致病菌。
乳酸菌的抑菌作用与很多因素相关。第一, 乳酸菌产生的有机酸如乳酸、乙酸、酒石酸和苹果酸等, 能降低环境pH值, 从而使大多数不耐酸的致病菌和腐败菌的生长繁殖受到抑制[30-31]。第二, 乳酸菌本身不含有过氧化氢酶, 但具有黄素蛋白氧化酶活性, 在有氧条件下能产生过氧化氢, 过氧化氢激活过氧化氢硫氰酸系统, 可抑制或杀灭大多数有害菌[32]。第三, 乳酸菌产生抗生素或细菌素类物质对有害菌具有杀菌作用[33]。乳酸菌产生的抑菌活性物质, 不仅破坏细菌的细胞壁和细胞膜结构, 可能还会产生孔洞[34], 影响细菌的细胞代谢, 导致细菌无法进行正常的生长和繁殖, 从而发挥抑菌作用[35]。如乳酸菌抗菌肽具有广谱和高效的抗菌活性, 在体内能够抑制病原微生物的生长繁殖, 增强机体免疫功能。斯木吉德[36]等人从新鲜酸马奶中筛选的1号菌株能够产生抗菌蛋白类代谢物。
乳酸菌代谢过程中的中间产物二氧化碳, 其自身具有抑菌活性的同时, 能够形成一个相对厌氧的环境, 抑制某些霉菌和革兰氏阴性菌的生长[37]。佳木泰等人从内蒙古牧区家庭手工制作的酸马奶中筛选出的8株乳酸杆菌均对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有抑制作用[38]。包科尔沁[33]等人从酸马奶样品中筛选得到一株乳酸菌SMN3-3, 其发酵乳上清液具有较好抑制肠道致病菌效果, 且对蛋白酶和热均具有良好的稳定性。贾燕等人分离到一株干酪乳杆菌XM-38可抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌, 具有较强的抑菌活性[39]。
酵母菌是人类利用最早的微生物之一, 广泛应用于肉类发酵制品、谷类发酵制品及酒精饮料食品中。酸马奶发酵成熟过程中, 酵母菌含量丰富, 能增进食欲、活化胰腺机能、促进消化;对慢性支气管炎、胃肠道溃疡、黏膜炎、重病后二次贫血等病症都具有较高的医疗价值[14]。酸马奶中的酵母菌分为乳糖发酵酵母、非乳糖发酵酵母和非糖发酵酵母等3种主要类型[17], 在代谢过程中能产生多种抗生素活性物质, 并能促进维生素B12的合成, 与酸马奶特有的营养价值和医疗保健作用密不可分[40]。
酵母菌的抑菌活性一般认为是通过代谢物如:乙醇、亚硫酸盐、乳酸等具有杀菌作用的小分子物质、肽类、吡嗪衍生物类及未知组成成分的抗菌素、杀菌毒素而产生的。酵母菌的杀菌系统是由一群能分泌毒素蛋白, 杀死敏感微生物的酵母菌组成。杀菌酵母菌对亲缘关系密切的同种其它菌株、其它真核生物及需氧放线菌、革兰氏阳性、阴性菌和生长缓慢的结核分枝杆菌都有抗性[15]。杀菌毒素是一种糖蛋白, 它由特定的质粒编码, 毒素效应与敏感微生物的胞壁受体结合, 从而导致细胞内pH值显著下降、代谢抑制、细胞死亡[41]。李丽杰[42]等人的研究结果表明, 酵母菌发酵液可产生抑菌物质, 但不属于标准六大类抗生素, 推测为是由蛋白质和小分子物质组成。赵美霞[43]等人从酸马奶酒样品筛选得到2株酵母菌的发酵液, 具有抑制结核分枝杆菌生长的功效, 这与国外试验结果相似:酵母菌的发酵液可在体外明显抑制结核分枝杆菌。
酵母菌和乳酸菌之间存在代谢物互补机制, 也就是说两种菌可以互相利用代谢产物, 有一定的共生作用[44]。如图2所示, 酵母菌为乳酸菌提供营养因子, 乳酸菌为酵母菌提供能量来源[45]。
图2 酸马奶中乳酸菌与酵母菌的共生发酵协同抑菌作用
在乳酸菌和酵母菌共生发酵过程中, 混菌发酵体系前中期产酸能力增加, 其内在原因可能是:氨基酸类代谢产物是促进乳酸菌生长的重要因子[11]。共生发酵的抑菌效果优于单独乳酸菌发酵[35], 是因为乳酸菌和酵母菌发酵产生酒精和二氧化碳, 能联合产生的低pH环境, 从而有效抑制不良微生物的活性[46];并且酵母菌可产生各种酶类, 完成酒精发酵, 还能与乳酸菌共同产生大量活性代谢物:如抗生素和有机酸等, 共同抑制病原微生物的生长繁殖。
关于抗菌物质抑菌机理, 一般认为抑菌剂的主要作用途径是膜攻击、抑制细胞呼吸或者抑制蛋白质的合成等[47]。Ishii[48]等研究发现:混合培养过程中酵母菌可以不断中和代谢产物中的乳酸, 从而降低高浓度乳酸对乳酸菌生长的抑制, 从而使得产物Nisin不断富集。Nisin作用于细胞壁, 通过阻止细胞壁中肽聚糖的合成, 使细胞壁质膜与磷脂化的合成不能正常进行, 导致细胞内的物质和一些三磷酸腺苷渗漏到胞外, 最终使细胞破裂致死来达到抑菌目的。Osprenova[4]等人观察发现酸马奶对结核分枝杆菌有很高的抗菌活性, 与其中乳酸菌、乙酸菌和酵母菌等代谢过程中产生的有机酸和抑菌物质有关。Khrisanfova[49]等报道, 马奶中的3种主要酵母菌能产生抗生素物质, 其中乳酸酵母产生的抗生素对结核分枝杆菌有更强的抗菌活性;且酵母菌与乳酸菌共存时其抗菌活性最强, 对有害微生物的抗菌作用更明显。酸马奶中的乳酸菌和酵母菌等微生物能产生不同种类的抗生素和有机酸, 这些生物活性分子对结核分枝杆菌以及其他有害微生物有较高的抗菌活性[6]。
马奶发酵成酸马奶的过程中, 微生物菌群代谢产生多种抑菌活性物质, 已成为近年来研究的热点。本课题组在Science Direct查询检索了关键词为“酸马奶”+各类主要抑菌活性物质(包括乙醇、有机酸、乳酸、乙酸、丙酸、免疫球蛋白、抗菌肽、乳铁蛋白、Nisin、溶菌酶、马乳脂、过氧化氢、乳过氧化物酶、亚硫酸盐、miRNA), 1996-2022年间1 653篇酸马奶中各抑菌物质发表文章数如图3所示。
由图3可知, 酸马奶中的抑菌物质大致分为:乳酸、乙酸等有机酸类共867篇;蛋白及酶类337篇;酵母菌发酵产物乙醇198篇;马乳中本身含有的马乳脂、亚硫酸盐等共248篇。其中乳酸为酸马奶中研究最多的抑菌物质, 其次是各类有机酸及酵母菌代谢产物乙醇;早年关于马乳脂抑菌的研究较多, 近年开始研究miRNA与免疫间关系。在发酵过程中, 酸马奶中的有益微生物如乳酸菌和酵母菌等, 能够降低环境的pH值, 产生不同种类的有机酸和抑菌活性物质, 从而对结核分枝杆菌以及其他有害微生物有较高的抗菌活性。
图3 近年来发表的有关酸马奶中各抑菌物质的文章篇数
马乳本身含有免疫球蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、乳过氧化物酶等抗菌物质, 作用机理如表1所示。马乳中C12:0和C18:3的含量分别为6.2%和12.6%, 其中α-亚麻酸和亚油酸均显著高于牛乳等其他乳, 是马乳具有杀菌作用的原因之一[50]。中亚地区由牛奶或马奶制备的发酵食品qymyz具有相同的抗结核分枝杆菌的作用, 已证实其抗菌作用与发酵原材料无关, 与微生物组成有关[51]。
表1 马乳中的抑菌物质及作用机理
脂肪是酸马奶重要组成成分之一, 其特点是低胆固醇含量和高多不饱和脂肪酸含量[9];酸马奶含有约80 %的甘油三酯、9%~10%的游离脂肪酸和5%~19 %的磷脂。马乳脂具有抑制结核分枝杆菌的作用[50,52-54]。侯文通[52]等人通过体外实验证实:马乳脂能够有效抑制结核分枝杆菌生长。孙惠平[50]等人研究发现, 马乳脂具有抑制结核分支杆菌生长的作用, 且马乳脂大剂量组(0.5 mL)抑菌效果明显优于小剂量组(0.1 mL)。酸马奶治疗结核病的临床效果表明, 其脂肪成分和酵母菌发酵液可以对抗结核病细菌[53]。孙健[54]等人进行了酸马奶酒的抗结核成分的粗分离实验, 发现马奶和马奶酒中粗脂肪对结核分枝杆菌具有抑菌作用, 但乳清没有明显作用。
酸马奶酒中检测到的有机酸包括草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。在发酵过程中, 一些有机酸(乳酸和乙酸)的浓度增加, 而其他有机酸(柠檬酸等)的浓度减少[32]。酸马奶中的乳酸起主要抑菌作用, 而醋酸和酒精的存在导致解离平衡向未解离乳酸方向移动, 提高了抑菌效果。通过对照酸马奶酒与模拟酸马奶酒中有机酸对枯草芽孢杆菌的抑菌作用发现:酸马奶酒的抑菌作用大于模拟酸马奶酒的抑菌作用, 这说明酸马奶酒很可能存在其它抑菌物质。孙健[54]等人的研究结果表明, 各因素对抑菌效果影响的大小顺序为乳酸>醋酸>酒精, 与国外文献报道的基本相一致。
外泌体是细胞分泌并进入体液或细胞外环境的小囊泡, 可以介导肿瘤微环境中的肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和间充质干细胞间的交流通讯, 在细胞间的通讯中发挥关键作用。马奶和酸马奶中存在大量的外泌体, 并具有不同的免疫调节作用。查干其其格[46]等人在培养实验中发现, 马奶外泌体能够促进小鼠巨噬细胞Raw264.7的肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL)-12p40以及IL-10分泌。IL-10是一种具有重要免疫调节功能的多效细胞因子, 可以影响免疫系统中许多细胞类型的活动, 与各种癌症如伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和非小细胞肺癌的生存、增殖和抗凋亡活性相关。酸马奶外泌体则能够促进抗炎因子IL-10的分泌, 具有免疫调节作用。
酸马奶的外泌体内含物中最为突出的是miRNA, 它以外泌体为载体, 到靶细胞和器官发挥降解信使RNA的作用, 参与机体发育、病毒防御、器官形成、细胞增殖和凋亡、以及免疫应答等生物体多种生理过程。其中miRNA表达和疾病(肿瘤等)病理过程密切相关, 可以作为疾病早期诊断、分型和预后判断的生物学指标。例如血液中的miR-25、miR-223可辨别非微细胞肺癌;外泌体来源的miRNAs可以通过调节肺癌细胞的免疫反应影响肺癌的发生发展[56]。已经有研究发现, 在人乳和牛奶中存在大量的miRNA。从营养学角度来看, 马奶的营养成分与其他畜种相比与人乳最相近[57];因此, 马奶和酸马奶中也许有能够调节免疫系统的特异性miRNAs, 从而具有治疗高血脂、体弱病残、高血压、肺结核、肠结核、糖尿病等疾病的特殊疗效。尹芳[58]等人研究表明, 细胞因子IL-2、IL-12及IL-18均能不同程度的增强结核分枝杆菌ESAT-6DNA疫苗的体液以及细胞免疫应答水平, 并显著提高其免疫保护效果。因此, 适当摄入酸马奶可以增强结核分枝杆菌疫苗的免疫保护作用, 从而辅助治疗结核病。
对于结核病等慢性疾病来说, 长期使用抗生素会使机体产生耐药性且对健康产生不利影响, 因此, 寻求一种绿色健康的方法治疗结核病尤为重要。酸马奶营养丰富, 有亦医亦食之效, 是治疗结核病最理想的天然药物之一[4]。在代谢产物方面, 酸马奶中益生菌代谢产生的细菌素、有机酸等成分对结核分枝杆菌具有较强的抗菌活性。在活性物质方面, 马奶中富含乳铁蛋白、马乳脂、溶菌酶、不饱和脂肪酸、多种抗体等多种抑菌物质;酸马奶的外泌体则能够促进抗炎因子IL-10的分泌, 具有免疫调节作用。此外, 酸马奶中的蛋白质、脂肪、糖类、矿物元素、维生素等也可为结核病患者补充营养。前苏联经过长期研究, 也认为发酵马奶制品qymyz是一种治疗性饮料, 具有治疗和改善结核病的作用[51]。另外, 酸马奶还对胃肠道疾病、支气管肺炎、干燥性胸膜炎等有很好的治疗效果[59]。
在中国, 蒙医使用酸马奶来治疗肺结核, 历史悠久, “酸马奶疗法”是蒙古族在长期的迁徙游牧生活过程当中积累的纯天然防病、治病的经验[12]。我国内蒙古锡盟蒙医研究所每年夏秋季用酸马奶来治疗肺结核等肺部疾病。红纲[60]等人用酸马奶结合蒙药治疗20名肺结核患者, 每天饮用酸马奶3~4次, 150~200 mL/次, 饭前0.5 h饮用, 结合蒙药治疗, 30 d为1个疗程。结果表明早期诊断患者酸马奶结合蒙药口服治疗1~2疗程缓解症状, 3个疗程基本痊愈;晚期或慢性期复发性肺结核病患者酸马奶结合蒙药口服治疗2~3疗程缓解症状, 5个疗程基本痊愈。查哈达等人对56例确诊结核病的病人采用酸马奶+蒙药治疗, 患者每天早、中、晚饮用酸马奶, 250~450 mL/次, 外加蒙药, 结果显示, 56例中治愈51例[2]。苏雅拉吉日嘎等人用酸马奶治疗31名肺结核患者及27名结核性胸膜炎患者。每天3次饮用酸马奶, 500~1 000 mL/次。服用时间根据病程长短决定, 一般7~49 d。治疗结果为痊愈占62%, 好转占34.5%, 未愈占3.5%[61]。卢海鹏等发现, 酸马奶可促进脾脏淋巴细胞、全血中T、B细胞的增殖, 调节机体免疫状态[62];且肺气肿患者饮用酸马奶后呼吸轻松、食欲提高、气色好转、体重增加[6]。酸马奶中含有的多种维生素及微量元素, 可以使患者营养得到充分补充, 进而增强机体免疫功能[63]。
青海省海洲蒙藏医院的查哈达经多年临床研究证明, 酸马奶对治疗结核病有较好的效果;酸马奶疗法对肺部疾病:如肺结核, 肺气肿等, 用有具有显著的疗效[2]。锡盟蒙医医院一直不断开发与研究酸马奶文化, 继续传承、推广并充分的开发利用酸马奶疗法[64]。
肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的慢性疾病, 由于抗生素药物的大量使用, 结核分枝杆菌的耐药性不断增加, 结核病治疗效果收效甚微, 因而寻找一种可持续的疗法变得尤为关键。酸马奶中含有大量营养物质和有益成分, 作为一种绿色保健品用于辅助治疗结核病, 具有广泛的应用前景。随着下一代测序技术的出现, UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的普及与应用, 可以更好探究酸马奶的有效抑菌成分及其作用机理。临床上现已使用酸马奶中的部分乳脂辅助治疗结核病, 未来有望培育高产量乳用型马, 以用于大规模提取马乳脂中的生物活性成分, 作为新型功能性食品或药物用于结核病的治疗。在不久的将来, 进一步深入探究酸马奶中有益微生物的抑菌机理, 系统性开发酸马奶疗法和现代医学相结合的模式, 从而更加精准有效地治疗结核病等疾病。