食品工业中混合菌生物被膜的形成、相互作用与新型控制策略

檀利军，王敬敬,3，彭知云，李玉锋，曾巧辉，赵 勇,*

（1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东 佛山 528000；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.华南食品安全研究发展中心，广东 佛山 528000；4.安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽 芜湖 241000）

在自然环境和食品工业中，大多数细菌主要是以生物被膜的形式存在。生物被膜是一种复杂三维结构的细菌聚集体，包裹在自产的水合胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）中，包括多糖、蛋白质、核酸和脂质等。由于生物被膜中细胞的生理变化与EPS介导的保护屏障，生物被膜对外界极端环境压力的抵抗力比浮游态细菌高1 000 倍以上。此外，生物被膜能够黏附在各种生物或非生物表面，从而给食品工业带来严峻的挑战。近年来，生物被膜已成为全球性的公共卫生问题，每年花费数10亿 美元来解决生物被膜引起的食品污染、设备损坏和人类疾病等问题。

事实上，包含多种细菌的混合菌生物被膜才是生物被膜的主导形式。然而，现阶段大多数研究都集中在对单菌生物被膜的探索，这些研究并不能准确反映生物被膜的真实情况。与单菌生物被膜相比，混合菌生物被膜中不同细菌之间具有更加复杂的相互作用，影响生物被膜的结构、发展和功能。因此，明确混合菌生物被膜的形成与种间相互作用有利于制定防控生物被膜污染的新型策略，对保障食品安全与公众健康具有十分重要的现实意义。

近年来，国内外研究开始聚焦混合菌生物被膜新型控制策略的开发，这些新型策略是消除食品工业中有害菌污染、维护食品健康可持续发展的有力手段，然而却缺少该方面的系统综述。因此，本文首先概述了混合菌生物被膜的形成与相互作用，介绍了近年来食品工业中控制混合菌生物被膜污染的一些新型策略，最后对混合菌生物被膜防控在食品工业中的发展进行了展望。旨在为食品工业中混合菌生物被膜的深入研究与制定有效的生物被膜新型控制策略提供新的见解和思路，以期更好地保障食品安全与公众健康。

1 食品工业中混合菌生物被膜的形成

食品工业中的有害菌能够在食品或食品接触表面形成生物被膜，危害食品安全与公众健康。例如，大肠杆菌O157:H7是一种常见的食源性致病菌，可在蔬菜和茎叶表面形成生物被膜。Silagyi等还发现大肠杆菌O157:H7能在家禽、肉类和即食熟食表面形成生物被膜。此外，单增李斯特菌、副溶血性弧菌与沙门氏菌也是食品工业中常见病原菌，已被证明可以在三文鱼、牡蛎和金枪鱼等海产品表面形成生物被膜。另一方面，腐败微生物引起的污染也是食品工业中面临的重要挑战。假单胞菌、希瓦氏菌与沙雷氏菌等优势腐败菌极易在食品或食品接触表面形成生物被膜。实际上，混合菌生物被膜才是有害菌在自然界和食品工业中的主要存在形式。因此，了解混合菌生物被膜的形成有利于阐明细菌生物被膜间的相互作用机制，从而更好地应对其带来的潜在风险。

1.1 混合菌生物被膜的形成过程

混合菌生物被膜中紧密聚集在EPS内多种细菌间存在复杂关联，其生长发育过程受到一系列物理、化学和生物过程的调控。与单菌生物被膜相比，混合菌生物被膜形成的机制与相互作用更为复杂，但其形成过程与单菌生物被膜基本相同，主要经历了3 个连续过程（图1）：1）黏附阶段；2）成熟阶段；3）分散阶段。

图1 混合菌生物被膜的形成过程Fig. 1 Formation process of mixed-species biofilms

在第一个阶段，浮游细胞在接触表面附近移动，通过物理作用力或细菌附着物（例如鞭毛或菌毛）黏附到接触表面。表面特性、温度和压力等不同因素可极大地调节细菌的黏附过程。细菌黏附到接触表面相关的作用力包括范德华力、空间相互作用和静电相互作用等。如果接触表面有利于细菌成熟发展便会由初级黏附阶段转变到次级黏附阶段。当吸引力大于排斥力时，一些可逆附着的细胞开始保持固定并变得不可逆附着。据报道，鞭毛或菌毛等附着物克服细胞和表面间的双重排斥力，巩固了细菌与接触表面之间的相互作用。当细菌黏附在非极性疏水表面时，细胞表面疏水性在生物被膜形成的过程中起到关键性作用。这是因为接触表面与细菌间的疏水相互作用降低了彼此间的排斥力。总之，在生物被膜形成发展的第一个阶段，微生物细胞与接触表面初步结合，然后通过相互作用力加强细菌细胞对接触表面的黏附。

生物被膜形成过程的第二个阶段是成熟阶段。在这个阶段，不同微生物细胞间通过产生自诱导信号分子进行交流，从而启动生物被膜特异性相关基因的表达。此外，细菌开始分泌EPS基质来构建生物被膜的结构网络。EPS中的胞外多糖促进细胞间的黏附和吸引，进而形成致密的生物被膜屏障；胞外蛋白可以增强EPS框架的稳定性；而胞外DNA则发挥着细胞之间形成复杂生物被膜网络结构的关键连接器与通讯媒介的重要功能。随后，微菌落的大小与厚度不断增加，进而提供了生物被膜细胞内部发展的空间与环境。简而言之，在这个阶段，生物被膜通过操纵其结构、生理和新陈代谢去适应外部条件从而形成成熟生物被膜。

最后一个阶段是生物被膜的分解。在这个阶段，生物被膜细菌群落开始产生多种裂解酶，这些酶靶向破坏EPS并降低其结构稳定性，从生物被膜内部释放的细菌重新转变为浮游态细胞。例如，荧光假单胞菌与铜绿假单胞菌释放海藻酸盐裂解酶；大肠杆菌释放-乙酰肝素多糖裂解酶；马链球菌产生用于分解生物被膜基质的透明质酸酶。细菌还可以通过上调鞭毛蛋白基因的表达，增强其自身的泳动性，使得细菌有利于转移到新的黏附位点。此外，生物被膜也可以通过物理机制主动分离，例如脱落和侵蚀。总之，混合菌生物被膜的形成是一个复杂的连续过程，理解混合菌生物被膜的形成有助于探究混合菌生物被膜间的相互作用机制，进而为开发新型控制策略提供新的见解和思路。

1.2 混合菌生物被膜形成的影响因素

混合菌生物被膜的形成受到接触表面的特性、食品基质成分、外在环境条件与细菌自身特性等多种因素制约。接触材料表面的特性包括疏水性、接触角、粗糙度与静电作用力等，这些参数往往共同作用并最终决定生物被膜的形成。然而，这些参数的具体影响在不同的实验条件下差异很大。例如，Guo Linxia等研究了副溶血性弧菌培养48 h后在不锈钢、聚苯乙烯与玻璃上生物被膜的形成情况，结果发现，生物被膜的形成能力依次是玻璃＞聚苯乙烯＞不锈钢。而Yan Jun等却发现腐败希瓦氏菌在以上3 种黏附表面生物被膜的形成能力依次是聚苯乙烯＞不锈钢＞玻璃。有研究表明细菌倾向于黏附在粗糙度更大的接触表面，而有研究却发现粗糙度与细菌附着之间并没有直接关联。同样地，尽管一些研究证明亲水性表面比疏水性表面更容易促进细菌黏附，但一些测试疏水性效果的研究中却得到完全相反的结果。此外，食品加工过程中最常见的接触材料是304不锈钢，因其具有较好的耐腐蚀、耐高温、易于清洁且价格低廉的优点而被广泛使用。然而，随着使用时间的延长，不锈钢表面容易出现裂缝或裂纹，反而成为细菌生物被膜的“庇护所”。实验结论的差异性可能是由于实验条件和细菌菌株的不同，也可能是多种因素共同制约的结果。

食品基质也是影响生物被膜形成的关键因素之一。例如，鲑鱼含有丰富的蛋白质、脂肪和碳水化合物，有利于微生物的生长和繁殖，进而促进单增李斯特菌与荧光假单胞菌混合生物被膜在其表面定植。牛奶中的乳糖通过激活LuxS介导的群体感应（quorum sensing，QS）系统促进细胞间的黏附，进而增强枯草芽孢杆菌生物被膜的形成。此外，牛奶中较高浓度的Ca与Mg也能促进嗜热菌属生物被膜的形成。另一方面，不同食品基质中形成混合菌生物被膜的微生物也有所差异。金黄色葡萄球菌也被称作“嗜肉菌”，极易作为优势菌在高蛋白乳制品与肉制品表面形成混合菌生物被膜；单增李斯特菌与腐败希瓦氏菌是冷链食品加工或贮存过程中最常见的“嗜冷菌”，能够在设备或冷藏食品表面形成生物被膜，黏附数月甚至长达数年，进而导致交叉污染和食品腐败变质；果蔬加工中的主要污染源是由多种真菌和细菌形成的混合生物被膜。因此，食品基质是探究混合菌生物被膜形成必不可少的影响因素。

外在环境条件包括温度、pH值、营养条件与氧气等也在生物被膜的形成过程中发挥着重要作用。Pang Xinyi等研究发现与4 ℃相比，15 ℃下单增李斯特菌与鲑鱼表面土著菌形成的混合菌生物被膜更致密，另外该团队还发现混合菌生物被膜在鲑鱼汁中的形成能力显著强于胰蛋白酶大豆肉汤培养基。最近有研究探究了环境条件和营养条件（pH值、温度、营养物）对单菌和混合菌生物被膜生长的影响，结果表明，混合菌生物被膜生长的最佳pH值为7，酸性或碱性条件都会显著抑制其生长。此外，生物被膜最佳生长温度在25～35 ℃之间，营养物浓度升高反而导致生物被膜形成减少。

细菌自身特性也是影响生物被膜形成的主要因素之一。不同种属类型的细菌，甚至是同种细菌之间生物被膜的形成能力差异很大。因为不同微生物之间具有菌株异质性，例如细胞疏水性、细菌附属物（菌毛与鞭毛）、细胞膜成分（脂多糖与蛋白质）以及分泌EPS的能力。Liu Xing等发现与无鞭毛的硫还原地杆菌相比，有鞭毛的菌株能够增加生物被膜内的电子扩散速率，进而增强生物被膜的形成能力。Tan Lijun等研究了副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌单菌和双菌生物被膜的动态形成过程，结果发现腐败希瓦氏菌具有更多的呼吸代谢系统，能够产生大量的EPS进而促进生物被膜生物量的增加。不同血清型和基因型菌株之间生物被膜形成能力也具有显著差异，这表明遗传背景也是影响生物被膜形成的重要因素之一。此外，在混合菌生物被膜中，不同细菌群落间往往伴随着复杂的相互作用，进而影响彼此生物被膜的形成。总之，混合菌生物被膜的形成不是某种单一因素作用的结果，而是受到多种因素的共同调控。明确混合菌生物被膜形成的影响因素有助于从源头阴断生物被膜形成，从而降低其在食品工业中带来的风险。

2 混合菌生物被膜间的相互作用

混合菌生物被膜中不同微生物群落间往往伴随着复杂强烈的相互作用，进而影响生物被膜的结构、发展和功能。这些相互作用可以是竞争或者协同的。探究混合菌生物被膜间的相互作用有助于靶向制定更有效的抗菌策略来控制生物被膜的形成。

2.1 竞争性相互作用

竞争性相互作用是指混合菌生物被膜中不同的微生物群落对有限的养料、生存空间和重要的代谢分子（如螯合剂、表面黏附素、多糖、信号分子和消化酶）等公共资源进行争夺或者通过分泌抑制其他群落生长的化合物的一种作用方式。在混合菌生物被膜中，一些细菌群落之间具有相同或相似的代谢需求，其中竞争性细菌通过积极消耗公共资源或产生抑菌物（细菌素、酶、过氧化氢和有机酸等）来降低其他菌株的适应性。例如，Pang Xinyi等研究发现，新鲜鲑鱼肉汤中的土著微生物与单增李斯特菌争夺混合生物被膜中的营养物质导致单增李斯特菌的细胞数量显著减少。假交替单胞菌属常是混合菌生物被膜中的优势竞争者，因为它能够产生一种抗菌蛋白（AlpP）杀灭竞争者中的敏感菌株。细菌黏附是另外一种竞争方式，有利于细菌细胞与非黏附细胞竞争。据报道，霍乱弧菌的EPS产生细胞具有高黏附性，在混合菌生物被膜中形成团簇并强制去除非EPS产生细胞。运动性也是混合菌生物被膜中重要的竞争手段，它通常可以增强细菌对养分的利用率，帮助破坏其他细菌形成的生物被膜。许多细菌通过VI型分泌系统（T6SS）竞争排除其他细菌群落。与单菌生物被膜相比，铜绿假单胞菌的T6SS和Psl胞外多糖在18 种菌株的生物被膜群落中被高度诱导，使其在混合菌生物被膜中比其他细菌更具有生长和适应性优势。细菌获得竞争优势的另一个重要策略是通过快速占据可用的黏附位点来避免其他菌株的定植黏附，称为“表面覆盖”。Chen Ping等通过荧光原位杂交技术对副溶血性弧菌与单增李斯特菌混合生物被膜的空间分布进行定位，结果发现，在混合生物被膜空间中单增李斯特菌位于副溶血性弧菌的下方，并占据了大部分的接触表面，这导致副溶血性弧菌的生物量与代谢活力显著下降。此外，铜绿假单胞菌迅速蔓延到接触表面并通过聚集和运动来防止根癌农杆菌的黏附，而铜绿假单胞菌运动缺陷基因突变体则无法在混合菌生物被膜形成中排除根癌农杆菌。

2.2 协同性相互作用

当混合菌生物被膜体系中所有微生物群落因其他微生物存在而以某种方式受益时，细菌间的作用方式称之为协同性相互作用（也称共生性相互作用）。协同性相互作用在混合菌生物被膜中非常普遍，通常会导致生物被膜形成的增加。Tan Lijun等发现副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌共培养时，混合生物被膜的生物量、活菌数与细胞活力显著高于单菌生物被膜。Chen Xiaoxue等也报道了在生肉加工环境中，金黄色葡萄球菌与产酸克雷伯菌双菌生物被膜的形成能力较单菌显著增强。甚至有一些细菌在单独培养时不会形成生物被膜，但与其他种类的细菌共培养后却开始形成生物被膜。混合菌生物被膜协同作用的一种方式是细菌群落共同抵抗外界极端环境压力。Piccardi等通过使用数学模型等工具揭示了4 种细菌的混合生物被膜能够降解金属加工液、工业冷却剂和润滑剂等有毒化合物的机制，认为每种菌株的解毒作用促进自身生存同时使其他菌株受益，从而协同促进菌株彼此更好地生长和降解有毒化合物。另一种协同作用方式是一种或几种细菌分泌EPS基质并被其他细菌群落积极利用。细菌生物被膜中的EPS提供稳定的结构和群落生存的动态微环境，是抵御外界环境刺激的庇护所。EPS赋予微生物群落间发生协同相互作用的基础，包括物理（黏附力、机械稳定性、保护性）、化学（pH值、氧气、无机离子、代谢物、信号分子）和毒力特性（抵抗杀菌剂和增加致病力）。据报道，在铜绿假单胞菌与肺炎克雷伯菌形成的混合菌生物被膜中，通过分泌3 种胞外多糖（海藻酸盐、Psl和Pel）增强整个群落对外界环境应激的响应能力。类似地，EPS中通过产生某些酶类（如-内酰胺酶）或抗性质粒可以保护整个混合菌生物被膜群落免受抗生素的侵害。此外，营养代谢物的相互利用也是一种协同作用方式，简单来说就是混合菌生物被膜群落中一种或几种细菌的代谢产物可以被其他细菌正向利用从而促进生物被膜的生长。Henson等在体外建立了多形拟杆菌、大肠杆菌与普拉梭菌3 种致病菌的混合生物被膜模型。乙酸盐由大肠杆菌和多形拟杆菌产生并由普拉梭菌所利用；二氧化碳由多形拟杆菌和普拉梭菌产生并被大肠杆菌与普拉梭菌消耗；乙醇由大肠杆菌产生被多形拟杆菌所利用。混合菌生物被膜群落间的代谢交叉利用成为了整个细菌群落间发生协同作用的驱动力。总之，混合菌生物被膜间的相互作用受到多种因素的综合影响，这些因素取决于微生物自身和环境，进而影响着生物被膜的形成、结构与功能。探究混合菌生物被膜相互作用机制，有助于靶向设计开发新型抗菌策略，从而彻底根除混合菌生物被膜在食品工业中的污染。

3 混合菌生物被膜的新型控制策略

混合菌生物被膜是食品安全相关的一个重大问题，因此广大学者对减少混合菌生物被膜在食品工业环境中的污染进行了广泛的研究。控制混合菌生物被膜传统的方法主要是热杀菌（高压蒸汽灭菌、微波加热等）与化学消毒（氯、过氧化氢、过氧乙酸和抗生素等）。然而热杀菌或化学消毒具有很大的弊端：破坏或改变食品原有品质、对食品加工设备有腐蚀作用、使细菌产生耐药性以及化学残留，容易对人体健康造成严重危害等。因此，开发混合菌生物被膜新型控制策略显得尤为重要。以下总结了一些近年来针对混合菌生物被膜的物理、化学和生物的绿色新型控制策略（图2）。

图2 混合菌生物被膜的新型控制策略Fig. 2 Novel control strategies for mixed-species biofilms

3.1 物理方法

3.1.1 光动力技术

光动力技术（photodynamic technology，PDT）是近年来从临床医学领域应用到食品工业上的新兴抗菌策略。在氧气存在的条件下，光敏剂被特定波长的光照射后其分子激发到高能量状态，在返回基态的过程中与邻近分子发生碰撞，产生高能量分子活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS能破坏脂质、蛋白质和核酸等大分子结构进而导致细胞死亡。

本课题组近年来对PDT灭活多种食源性致病菌与腐败菌进行了广泛深入的研究。目前已证明PDT对副溶血性弧菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、腐败希瓦氏菌等多种有害菌的浮游菌和生物被膜均具有显著的灭活效果。此外，多位研究者也证实了PDT清除混合菌生物被膜的高效性。例如，Banerjee等发现核黄素介导的PDT对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合生物被膜有显著抗菌作用。Tan Lijun等开发了一种PDT耦合弱碱性电解水高效清除混合菌生物被膜的新技术，在150 μmol/L光敏剂和4.56 J/cm能量照射下，PDT结合弱碱性电解水使混合菌生物被膜的生物量、活菌数和细胞活力分别显著降低72.4%、3.51（lg（CFU/mL））和85.7%，此外，还发现该技术同样能高效清除食品（鱼鳞）或食品接触表面（不锈钢）上形成的混合菌生物被膜。PDT优良的抗生物被膜功效使得其在食品保鲜、食品包装、水体消毒等领域具有广泛的应用。此外，PDT还具有装置简单、成本低、效率高等优点，更重要的是这种非热杀菌技术不会导致细菌产生耐药性。然而，由于食品和食品加工环境的多样性，PDT在实际应用时其抗菌或保鲜功效可能会受到影响。因此，未来对PDT的研究应该聚焦于开发或筛选更加高效的新型光敏剂以及进一步探究PDT对食品品质与营养特性的影响，以便于PDT在食品工业中大规模应用。

3.1.2 冷大气等离子体

等离子体是自然界中物质的4 种基本状态之一，主要包括分子、中性原子、带电粒子、亚稳态自由基和光子等活性成分。冷大气等离子体（cold atmospheric plasma，CAP）被认为是一种快速、环保、节能和多功能的抗菌技术，其中的活性成分能协同灭活多种微生物并破坏生物被膜中的EPS基质。近年来，CAP在食品工业等领域得到了广泛的研究。

CAP也已被证明是控制混合菌生物被膜的新型策略之一。Patange等表明，用高压CAP处理非生物表面上单增李斯特菌和荧光假单胞菌混合生物被膜，仅120 s后便无法检测到存活细菌；而处理生菜上的混合菌生物被膜需要更长的时间，在封闭处理120 s后，单增李斯特菌与荧光假单胞菌数分别减少了2.2（lg（CFU/mL））与4.2（lg（CFU/mL））。Govaert等报道了CAP处理单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌混合生物被膜后，活菌数降低了1.5～2.5（lg（CFU/mL））。CAP目前在食品领域的应用大多是在实验室条件下对食品或食品接触表面的抗菌研究，这主要与其过高的成本和对食品品质容易产生不利的影响有关。因此，未来的研究应不断优化CAP抗生物被膜的工艺与降低成本，这将有助于CAP在食品工业上的进一步应用。

3.1.3 抗生物被膜材料

食品接触表面的性质决定了食品加工环境中生物被膜的形成与阴力。因此，通过改变接触表面的理化性质或对接触表面进行改性可以从源头解决生物被膜形成的污染。抗生物被膜材料是指通过改变材料表面理化性质或在表面涂层加入抗菌剂来抑制生物被膜生长的一种新型功能性材料。

食品工业中常见的接触材料包括食品加工器械/管道、食品包装等。类金刚石碳涂层由于其高硬度、低摩擦、化学惰性、高耐磨性和防污性能，已成为食品工业中不锈钢的替代品。有研究表明，类金刚石涂层对大肠杆菌与成团泛菌混合生物被膜形成具有良好的抑制效果。此外，牛奶板式换热器会导致蛋白质变性，进而形成污垢，同时也加速了细菌在表面的黏附，并最终导致生物被膜的形成。Jindal等比较了常规不锈钢板式换热器与改良表面的板式换热器在牛奶杀菌过程中生物被膜的形成情况，结果发现改良板式换热器表面的生物被膜活菌显著低于不锈钢表面。生物表面活性剂在接触表面可以改变其疏水性，进而影响生物被膜的形成。例如，线性低密度聚乙烯中加入的聚((叔丁基氨基)-甲基-苯乙烯)后，不仅能完全抑制单增李斯特菌生物被膜的形成，还显著延迟了金黄色葡萄球菌与大肠杆菌混合生物被膜的定植。抗生物被膜材料能够从源头降低混合菌生物被膜的污染，因此，未来应进一步开发安全、高效、价格低廉的抗生物被膜复合材料，以更好地应用到食品加工器械/管道与食品包装等领域。

3.2 化学方法

3.2.1 天然产物

许多植物来源的天然产物因为具有特殊的化学结构而表现出一定的抗菌和抗生物被膜活性。天然产物的抗生物被膜作用主要依靠抑制细胞的黏附和附着、阴断EPS的形成以及减少毒力因子的产生，从而阴断QS网络和生物被膜的发展。

这些天然产物包括精油、姜黄素、酚酸和多酚化合物等。精油是一种天然化合物，可替代消毒剂用于控制混合菌生物被膜。Kerekes等报道了马郁兰精油对多种食源性致病菌与腐败菌混合生物被膜形成具有良好的抑制效果。同样地，在低浓度香芹酚的持续影响下，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌形成的混合生物被膜未能发展为成熟的生物被膜，并且在高浓度香芹酚下完全无法形成生物被膜。因为香芹酚能干扰细菌生物被膜，导致细胞内ATP和钾离子泄漏，最终导致细胞死亡。值得注意的是，精油在实际应用中可能会挥发出强烈的气味，并且在消毒后难以冲洗干净。然而，有研究者报道了一种名为“Satureja thymbra”的精油水溶胶对致病菌与腐败菌混合生物被膜具有良好的抗菌作用。这种精油水溶胶在使用后很容易清洗干净并且没有刺鼻的气味。其他植物来源的天然产物也具有抗生物被膜的功效。例如，在酚酸（阿魏酸和水杨酸）存在的情况下，蜡样芽孢杆菌和荧光假单胞菌双菌生物被膜的复原力和对外界环境刺激的抵抗力会降低，这可能是由于酚酸干扰了混合菌生物被膜形成时的相互作用。以上研究结果表明，不同植物来源的天然产物对多种有害菌混合生物被膜具有显著抑制作用。现阶段，从天然产物中提取有效抗菌成分作为食品防腐剂是各国的研究热点。因此，未来的研究应进一步评估天然产物作为食品防腐剂的安全性以及开发高效廉价的天然产物抗菌剂，旨在深入挖掘天然产物在食品工业中的真正潜力。

3.2.2 酸性电解水

电解水因成本低、对环境友好和应用方便而被广泛应用于食品领域。大量研究表明，酸性电解水（acid electrolyzed water，AEW）对多种有害菌生物被膜及混合菌生物被膜具有优良的抑制活性。AEW杀菌的主要机制是低pH值、高氧化还原电位（oxidation-reduction potential，ORP）与有效氯的协同作用。低pH值使细胞内环境失衡更容易受到有效氯的影响，导致更多的次氯酸分子穿过细胞膜进入细胞破坏内部关键结构；而高ORP的氧化作用会损伤细胞膜或改变细胞的正常电子流，从而造成细胞损伤或死亡。

有研究表明，AEW对荧光假单胞菌属生物被膜具有高效的抗菌活性，此外还发现AEW增加了细菌细胞膜的通透性，降低了膜电位、细胞内ATP浓度与pH值，同时也破坏了EPS基质并最终清除生物被膜。Hu Haijing等发现AEW随着处理时间的延长对不锈钢上肠炎沙门氏菌与荧光假单胞菌混合生物被膜的杀菌效果逐渐增强。由于AEW抗菌的高效性和自身特殊的性质，使得其在食品工业中常被用于食品加工设备表面消毒与果蔬保鲜，包括抑制有害菌的生长、维持营养或化合物生物活性和去除农药残留。然而，AEW因其低pH值与高有效氯浓度容易改变食品原有品质。因此，降低AEW对食品品质的影响以及推广大型AEW生产设备的普及有利于扩大其在食品工业领域的应用范围。

3.3 生物方法

3.3.1 抗生物被膜酶

生物被膜的本质是由EPS包裹的微生物聚集体，因此使用生物方法对抗生物被膜是一种“以子之矛，攻子之盾”的最佳策略之一。EPS基质为嵌入生物被膜的细菌提供了“保护伞”，而使用抗生物被膜酶这种绿色抗菌剂可有效破坏EPS中的多糖、蛋白、脂质和核酸，从而靶向根除生物被膜。抗生物被膜酶多与杀菌剂相结合，能够瓦解EPS网络，促进消毒剂与抗菌剂的渗透，中断控制生物被膜形成和维持的细胞间通讯信号，也有助于减少化学试剂的使用、水消耗和能源成本。

目前用于去除生物被膜的酶主要包括蛋白水解酶、多糖降解酶、氧化还原酶和抗QS酶4 大类。蛋白水解酶主要用于水解EPS基质中的各种蛋白质或使细菌黏附在接触面的一些黏附蛋白；多糖降解酶包括溶菌酶、纤维素酶和淀粉酶等，主要降解生物被膜中的多糖结构；氧化还原酶可以靶向攻击EPS中的eDNA，阴碍生物被膜的形成、成熟、扩散以及细胞间的连接；抗QS酶通过中断生物被膜内细胞间通讯，导致细胞群落代谢紊乱。由于酶特异性以及生物被膜基质的复杂性，因此往往需要多种酶联合使用才能高效去除混合菌生物被膜。然而，现阶段抗生物被膜酶的高成本和低商业普及性限制了其在食品工业上的应用。此外，食品工业中环境的复杂性，如温度、pH值、食物残渣、加工表面多样性也是影响酶发挥功效的关键因素。抗生物被膜酶是一种富有前景但又充满挑战的绿色新型抗菌策略，未来研究应继续优化生产工艺，降低生产成本，并继续深入探究其对生物被膜的作用机制及其与其他抗菌手段的协同抗菌作用，如结合光热催化反应、纳米催化和金属离子等协同抗菌策略，进而提高抗菌效力和特异性。

3.3.2 QS抑制剂

QS通过介导生物被膜细胞间的通讯，是调控生物被膜形成的重要因素。而QS抑制剂是中断/阴碍QS系统的一类物质，主要包括降解自诱导物的酶（如内脂酶、酰胺酶、细胞色素氧化酶等）、一些天然化合物（如吲哚类及其衍生物、黄酮类、生物碱、有机硫化物等）与QS合成类似物（酰基-高丝氨酸内酯类似物）。

例如，已发现香兰素（一种从植物中提取的天然化合物）是一种很有前景的QS抑制剂。在质量浓度0.05、0.15 mg/mL和0.30 mg/mL香兰素存在的条件下培养24 h后，混合菌生物被膜的生物量分别减少9%、25%和52%。进一步研究发现，香兰素能够显著减少生物被膜中胞外多糖（17%）和胞外蛋白（28%）的产生。类似地，抗菌肽LL-37能够使铜绿假单胞菌中QS失调，并抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌混合生物被膜形成。现阶段，QS抑制剂主要应用于水产养殖病害防控、食品保藏（如肉制品和果蔬制品）等。然而，QS抑制剂较强的特异性以及过高的成本导致其普适性和应用性降低。此外，混合菌生物被膜内部不同细菌之间的QS信号十分复杂，对QS抑制剂发挥作用产生很大的干扰。因此，未来需要进一步解析QS互作网络调控机制，并开发新型高效的QS抑制剂，尤其是天然产物QS抑制剂，从而为靶向设计新型抗菌剂提供新的途径。

3.3.3 噬菌体

噬菌体是一种在自然环境中存在的病毒，只感染细菌而不会对食品或人体等造成风险，是名副其实的细菌“捕食者”。噬菌体能够攻击生物被膜中的细菌，可以和宿主共存，将遗传物质整合到细菌基因组中，随后噬菌体在细菌体内复制，并最终裂解细菌并释放出能够感染更多细菌的噬菌体。因此，噬菌体是一种天然、高特异性和无毒的混合菌生物被膜新型控制策略。

当噬菌体与生物被膜接触时，会进一步发生相互作用，结果取决于生物被膜细胞对噬菌体的敏感性和受体位点的可及性，因为致密的EPS屏障可能会隐藏这些受体位点。然而一些噬菌体能编码EPS基质降解酶，使其自身能够渗透进入生物被膜进而与内部细菌细胞相结合，并最终裂解细菌。一般情况下，多种噬菌体联合使用往往显示出更好地控制效果。Montso等评估了牛肉上多重耐药的大肠杆菌生物被膜分别对8 种噬菌体和6 种噬菌体混合物的敏感性，结果发现，单个噬菌体和噬菌体混合物均能抑制大肠杆菌生物被膜的形成，噬菌体混合物则显示出更高的抑制效率。目前噬菌体在食品工业中的具体应用主要有鲜切食品的保鲜、水产养殖中的病害防控治疗、畜禽产品的抑菌等。然而噬菌体控制混合菌生物被膜也会存在一定的局限性，因为噬菌体具有高度的特异性，在使用前往往需要对目标菌株进行鉴定。因此，需使用噬菌体混合物、工程噬菌体、酶类以及其他抗菌剂组合来克服这一障碍。此外，噬菌体控制生物被膜的效率容易受到外界环境因素（温度、生长阶段与噬菌体浓度等）的影响。总而言之，噬菌体抗菌技术将会是今后食品工业中防控混合菌生物被膜污染的重要手段之一，未来的研究需要进一步明确噬菌体在不同食品加工环境中与病原菌的相互作用、抗性等问题，以此来提高噬菌体抗菌的应用效率。此外，阐明混合菌生物被膜如何影响噬菌体敏感性相关成分有助于提高其有效性和安全性。

4 结 语

混合菌生物被膜是食品工业中最常见的污染形式，然而现阶段绝大多数研究都是基于单菌生物被膜。由于混合菌生物被膜形成的结构与彼此间的相互作用极其复杂，因此，探究混合菌生物被膜形成和相互作用有利于更好地靶向制定生物被膜污染的防控策略。近年来，越来越多的研究开始聚焦于发展控制混合菌生物被膜的新策略以期应对其带来的潜在风险，进而促进食品安全可持续发展。本文基于食品工业中混合菌生物被膜的研究现状，对未来混合菌生物被膜的研究方向提出以下几点展望，旨在为制定混合菌生物被膜新型控制策略、彻底消除食品工业中混合菌生物被膜的污染提供新的见解和思路，从而更好地保障食品安全与公众健康。

4.1 进一步揭示混合菌生物被膜间的相互作用

现阶段对混合菌生物被膜相互作用的理解仍非常有限，进一步解析混合菌生物被膜群落间的相互作用对在食品工业中制定有效的生物被膜污染防控策略至关重要。因此，需要进一步了解混合菌生物被膜在食品及食品接触表面的持久性、开发检测混合菌生物被膜的新方法或工具来揭示混合菌生物被膜间的相互作用，从而建立更加高效的新型控制策略。

4.2 联合多种新型控制策略根除混合菌生物被膜

虽然目前已有有效的混合菌生物被膜新型控制策略，但仍然无法彻底解决混合菌生物被膜在食品工业中的污染问题。因此，联合两种或两种以上的方法来控制混合菌生物被膜的污染往往更加高效，不同的抗菌策略相互取长补短，进而发挥协同抗菌的功效。

4.3 推动混合菌生物被膜新型控制策略在食品工业中的应用

上述控制策略在实验室条件下都表现出良好的应用潜力。然而，食品工业中生物被膜的真实情况往往比实验室研究复杂得多，这些新兴的控制策略可能在食品工业中应用时会遭遇阴碍。首先，必须保证这些混合菌生物被膜新型控制策略是安全的；其次，必须保证这些方法与技术不会明显改变或破坏食品原有的品质；最后，必须保证它们在食品工业中的应用性，包括可接受的成本、在各种食品加工环境下的可操作性等。推动混合菌生物被膜新型控制策略在食品工业中的应用应从以上3 个方面努力实现，从而提高食品质量与安全，并最终保障公众健康。