冷藏对草鱼肉超微结构及代谢物的影响

郭薇丹，周湘人，徐莉娜，付湘晋,3,4,*

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省特殊医学食品重点实验室，湖南 长沙 410004；3.湖南省营养健康品工程技术研究中心，湖南 长沙 410004；4.湖南省调味料绿色制造工程技术研究中心，湖南 长沙 410004）

草鱼是世界上养殖量、产量最高的鱼种，年产量约400万 t。作为中国特色的养殖品种，草鱼肉质鲜美，富含必需氨基酸及多不饱和脂肪酸，营养价值高。低温能抑制鱼体内酶的活性和微生物的生长繁殖，冷藏是草鱼常用的贮存方法。冷藏过程中草鱼肉品质变化是研究热点，如冷藏过程中蛋白质降解、脂肪氧化及挥发性物质、核苷酸、生物胺含量和微生物数量变化等都已有研究报道。相应的研究结果用于解释品质形成、劣化机制及建立品质、新鲜度指标，如硫代巴比酸反应物（thiobarbituric acid substances，TBARS）值、值（鱼类新鲜度评价指标）、生物胺含量、菌落总数等。

代谢物组学是解析食品品质形成的新工具，可从整体全面分析食品中小分子成分变化。有文献报道了猪肉、贝肉、鸭肉、鸡肉等在冷藏过程中代谢物组的变化。例如，Muroya等基于毛细管电泳-飞行时间质谱的猪肌肉代谢组学分析探明了猪肉成熟过程中相关代谢途径的机制，宰后猪背最长肌、股中间肌中腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷一磷酸（inosine monophosphate，IMP）和肌苷（inosine，HxR）的含量在成熟过程中变化规律不同，腺苷酸激酶和5’-核苷酸酶是控制猪肉品质关键酶，与猪肉风味的形成密切相关。Aru等分析了0 ℃和4 ℃下贻贝腐败过程中的代谢谱变化，在贮存过程中，醋酸盐、乳酸、琥珀酸、丙氨酸、支链氨基酸、三甲胺含量显著增加，同时甜菜碱、肌碱和牛磺酸等含量逐渐降低，它们可能是潜在的贻贝腐败生物标志物。Liu Chunli等分析了鸭肉代谢物与其育龄之间的关系，结果表明4 个不同育龄期的鸭肉代谢物之间存在显著差异，随着育龄的增长，乳酸和鹅肌肽含量增加，富马酸、甜菜碱、牛磺酸、HxR、取代烷基的游离氨基酸含量减少。Wen Dongling等发现鸡肉在冷藏过程中大多数氨基酸含量减少，而生物胺含量增加，此外结合IMP及其代谢产物含量发现冷藏鸡肉的保质期最长为6 d，最佳食用时间应为冷藏4 d之内。

冷藏草鱼肉的代谢组学鲜有研究报道。本实验采用气相色谱-飞行时间质谱（gas chromatograph-time of mass spectrometer，GC-TOF-MS）法和透射扫描电子显微镜分析草鱼肉冷藏过程中（4 ℃，0、24、72 h）代谢物组和超微结构的变化，通过数据分析筛选，鉴定变化显著的关键代谢产物及途径，以期为冷藏草鱼肉品质形成机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活草鱼（）购自长沙乐尔乐超市。

甲醇（色谱纯） 德国CNW科技公司；氯仿、吡啶（色谱纯） 上海Adamas有限公司；甲氧铵盐（分析纯） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；核糖醇（分析纯） 美国Sigma公司；双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA）试剂（含体积分数1%三甲基氯硅烷（trimethyl chlorosilane，TMCS）） 美国Regis公司。

1.2 仪器与设备

7890 GC-TOF-MS、DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美国Agilent公司；JXFSTPRP-24研磨仪 上海净信科技有限公司；BSA124S-CW分析天平 德国Sartorius公司；Heraeus Fresco17离心机 美国赛默飞世尔科技公司；PS-60AL超声仪 深圳市雷德邦电子有限公司；LNG-T98真空干燥仪 太仓市华美生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 草鱼的预处理

参考文献[10]进行草鱼预处理，选取（2 000±110）g/尾鲜活草鱼，击打头部致死，去内脏、鳞、头，剖边，冷水（4 ℃）清洗，再用体积分数75%乙醇溶液擦拭鱼体表面，在超净工作台中用无菌刀片取鱼背部白肉，切成约3 cm×3 cm×2 cm的长方体，装入无菌保鲜袋，（4.0±0.5）℃冷藏0、24、72 h。

1.3.2 透射电子显微镜观察鱼肉结构

参照付湘晋等的方法采用透射电子显微镜观察鱼肉结构。

1.3.3 鱼肉代谢物分析

1.3.3.1 提取及衍生化

取无刺白肉（200±1）mg于5 mL EP管中，加入1 800 μL预冷提取液（甲醇、水体积比3∶1），再加入20 μL核糖醇溶液（200 mg/mL），涡旋30 s；加入钢珠，35 Hz研磨仪处理4 min，超声5 min（冰水浴）；将样本4 ℃、10 000×离心15 min；小心移取150 μL上清液于1.5 mL EP管中；在真空浓缩器（28 ℃）中干燥提取物；向干燥后的代谢物加入40 μL 20 mg/mL甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐溶于吡啶），轻轻混匀后，80 ℃孵育30 min；向样品中加入60 μL BSTFA试剂（含有1% TMCS），将混合物70 ℃孵育1.5 h。取出离心管，冷却至室温，加1 mL己烷，涡旋30 s使其混合均匀，冷冻离心，取上清液待GC-TOF-MS分析。

1.3.3.2 GC-TOF-MS分析

GC条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；进样量1 μL；不分流；进样口温度280 ℃，载气氦气；流速1 mL/min；升温程序：50 ℃保持1 min，10 ℃/min升温到310 ℃，保持8 min；MS条件：传输线温度280 ℃，电子电离源，电离电压-70 eV，离子源温度250 ℃，质量扫描范围50～500 Da。

1.3.3.3 代谢物定性、定量分析

使用ChromaTOF V 4.3x软件对MS数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。代谢物定性使用LECO-Fiehn Rtx5数据库，进行MS图谱及保留指数匹配；以核糖醇为内标进行定量，采用SIMCA软件对代谢物组成进行主成分分析。＜0.05且差异倍数（fold change，FC）大于1.5或小于1/1.5的物质识别为差异代谢物。

1.3.4 分子对接分析

利用AutoDock Vina软件模拟胡椒碱、柚皮素、茉莉酸甲酯、马钱子苷、-蛔蒿素、枞酸、3,4-二羟基扁桃酸与黄嘌呤氧化酶的相互作用。分别从美国国家生物技术信息中心药物信息综合数据库（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和蛋白数据库（Protein Data Bank，PDB）（http://www.rcsb.org/pdb）中获得小分子代谢物的三维结构和黄嘌呤氧化酶（PDB：1FIQ）的晶体结构，并保存为mol2和pdb格式。采用Autodock Vina等软件处理上述文件，并保存为pdbqt文件。设置对接盒子，保存config.txt（配置文件）。最后，采用Autodock Vina软件进行药物分子与受体蛋白的对接，完成后用PyMOL软件进行可视化分析。

1.4 数据处理与统计

实验设置3 个平行，结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行差异显著性分析，＜0.05表示差异显著。采用GraphPad软件绘图。

2 结果与分析

2.1 冷藏对草鱼肉超微结构的影响

新鲜草鱼肉及冷藏24、72 h鱼肉的超微结构见图1。新鲜鱼肉肌节清晰、整齐，肌纤维间隙较小；随着冷藏时间延长，肌纤维间隙变大、排列散乱，部分肌节断裂；与Ge Lihong等的研究结果一致。冷藏过程中，鱼肉肌节断裂，肌纤维间隙变大，主要与蛋白酶（如组织蛋白酶、钙激蛋白酶、Caspase等）降解肌原纤维蛋白有关。随着冷藏时间延长，肌纤维间隙中的线粒体颗粒明显肿胀，在冷藏72 h鱼肉中，部分线粒体颗粒崩解。在冷藏金边鲷（）鱼肉研究中也发现，随着冷藏时间的延长，线粒体逐渐崩解，线粒体完整性可作为鱼肉新鲜度指标。

图1 冷藏对草鱼肉超微结构的影响Fig. 1 Effect of cold storage on the ultrastructure of grass carp muscle

2.2 冷藏草鱼肉代谢物组分析结果

2.2.1 冷藏草鱼肉差异代谢物识别

采用GC-TOF-MS从草鱼肌肉中共检测到211 种代谢物，包括糖类、氨基酸、脂肪酸、核苷酸和胆固醇等。含量最高的代谢物是肌酸（25～30 mg/g），表明肌酸激酶途径在草鱼肉能量代谢中有关键作用。肌酸激酶与胞内能量转运、肌肉收缩、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）再生有直接关系，当鱼死亡且没有能量可供利用时，磷酸肌酸就会迅速转化为肌酸。Savorani等在金边鲷肉中也检测到大量肌酸，可能的原因是肌酸及磷酸肌酸是鱼肉中重要的能量储存物质。草鱼肉中含量较高的其他氨基酸有丝氨酸（0.20～0.76 g/kg）、丙氨酸（6.90～12.69 g/kg）、甘氨酸（2.19～4.36 g/kg）、牛磺酸（6.20～9.27 g/kg）、酪氨酸（0.50～1.24 g/kg）、氨基丙二酸（0.47～1.78 g/kg）。鱼肉是膳食中游离态牛磺酸主要来源之一，草鱼肉中牛磺酸含量较高，是其高营养价值的体现，且牛磺酸含量与胆固醇代谢途径密切相关。对冷藏期间草鱼肉代谢物组成进行主成分分析，结果如图2所示，不同贮藏时间的样品分别聚集在不同象限。

图2 不同冷藏时间草鱼肉代谢物的主成分分析结果Fig. 2 Principal component analysis of metabolites in grass carp muscle at different cold storage time

以含量显著变化（＜0.05）且FC＞1.5或＜1/1.5的代谢物为差异代谢物。如图3所示，冷藏72 h草鱼肉中识别到42 种差异代谢物，其中18 种代谢物含量显著增加，包括氨基酸（缬氨酸、-半胱氨酸、GABA）、核苷酸（腺苷、尿嘧啶、尿苷、胞苷、HxR和5,6-二氢尿嘧啶）、有机酸（乳酸、葡萄糖二酸）以及苯乙醛、磷酸、3-羟基丁酸、4-HB。其中葡萄糖二酸、苯乙醛、磷酸、5,6-二氢尿嘧啶（数据未列出）在新鲜鱼肉中的含量低于冷藏鱼肉的检出限，是冷藏过程中新产生的代谢物。冷藏72 h草鱼肉中24 种代谢物含量显著减少，主要包括脂肪酸类、糖类、胆固醇激素类等；其中丙酮酸盐、亚麻酸含量变化最大。

图3 冷藏72 h草鱼肉中识别的差异代谢物Fig. 3 Differentiated metabolites identified in grass carp muscle during 72 h cold storage

大部分差异代谢物归属于糖酵解代谢、ATP代谢、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环代谢、氨基酸及脂肪酸代谢。胆固醇代谢途径中肾上腺甾酮、雄酮、三羟基胆甾烷含量显著降低；而5-二氢皮质醇、三羟基粪甾烷含量显著增加，其中三羟基胆甾烷、三羟基粪甾烷含量虽发生显著变化，但FC在1/1.5～1.5之间。胆固醇类物质是膜结构中主要成分之一，胆固醇类代谢物含量的变化表明冷藏过程中鱼肉细胞膜结构发生改变，与透射电子显微镜观察结果（图1）一致。

此外，差异代谢物中苯乙醛可依赖于NADH的醇脱氢酶催化转化成苯乙醇，苯乙醛、苯乙醇都具有花、水果香味，可能对草鱼肉气味有一定贡献。本研究还发现马钱子苷、松香酸含量显著减少，这些植物性代谢物可能来源于草鱼的食物。

2.2.2 冷藏草鱼肉糖酵解途径代谢物及酸类化合物累积

动物在宰杀后，肌肉中供氧终止，有氧代谢基本停止，糖类主要进行无氧酵解。冷藏草鱼肉中糖酵解代谢途径相关代谢物含量变化见图4。冷藏过程中，糖原、蔗糖、葡萄糖、丙酮酸的含量显著降低（＜0.05），乳酸、葡萄糖二酸含量显著增加（＜0.05），但葡萄糖二酸含量远低于乳酸。乳酸水平增加至贮藏初始的2 倍。此外，磷酸含量从低于检出限（2 mg/kg）增加到400 mg/kg（磷酸参与通路较复杂，图4H未列出），在有机酸中含量仅低于乳酸。因此磷酸、乳酸的累积是冷藏草鱼肉pH值下降的主要原因之一。

图4 冷藏对草鱼肉中糖酵解途径代谢物的影响Fig. 4 Effect of cold storage on glycolysis metabolites in grass carp muscle

2.2.3 冷藏草鱼肉三羧酸循环代谢物含量的变化

冷藏鱼肉中检测到大量TCA相关代谢物，如柠檬酸、琥珀酸、富马酸、马来酸（图5）。其中只有琥珀酸的含量显著降低（＜0.05）；同时，4-HB、3-羟基丁酸以及GABA含量显著增加（＜0.05），表明冷藏草鱼肌肉中TCA循环代谢途径基本停止，琥珀酸转化成琥珀酸半醛，致使GABA与4-HB含量显著增加。

图5 冷藏对草鱼肉中TCA循环代谢物的影响Fig. 5 Effect of cold storage on TCA cycle metabolites in grass carp muscle

不同肉类在冷藏中TCA循环代谢物的变化规律有一定差异，如猪肉、河蚌冷藏过程中琥珀酸含量均显著增加（＜0.05），而冷藏鸭肉中TCA循环代谢物中只发现富马酸含量显著下降（＜0.05）。琥珀酸含量增加及富马酸含量降低都与SDH的失活有关。SDH是TCA代谢途径中唯一定位于线粒体内膜上的酶，可催化琥珀酸氧化生成富马酸，并且SDH对线粒体膜结构的变化非常敏感，线粒体膜结构失常会导致SDH失活。草鱼肌肉冷藏过程中线粒体膜结构逐渐崩解（图1），宰杀后线粒体在活性氧（reactive oxygen species，ROS）、凋亡蛋白酶、磷脂酶等多因素作用下，其膜结构逐渐被破坏，因此，宰后肉类中琥珀酸含量的变化可间接反映线粒体膜结构完整性。GABA、4-HB含量的变化与冷藏时间正相关。冷藏72 h，4-HB含量从5 mg/kg累积到约60 mg/kg，变化趋势与值类似，可作为检测冷藏草鱼肉新鲜程度的潜在指标。在值测定中需用较高浓度的高氯酸提取ATP、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、AMP，由于高氯酸可助燃，具强腐蚀性，所以值的测定具有一定危险性。相对而言，琥珀酸、4-HB、GABA含量的测定更加安全。

2.2.4 冷藏对草鱼肉中脂肪酸、氨基酸含量的影响

草鱼肉富含多不饱和脂肪酸，非常易被氧化，产生异味。冷藏72 h草鱼肉中，十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、顺-11-二十碳烯酸、花生酸、亚麻酸、花生四烯酸等脂肪酸及单棕榈酸甘油酯、2-油酸单甘油酯、1-油酸单甘油酯（部分物质含量变化FC在1/1.5～1.5之间，故数据未列出）的含量显著降低（＜0.05），只有壬二酸含量显著增加（＜0.05）（图3）。亚麻酸、花生四烯酸、壬二酸含量变化见图6A、B。壬二酸来源于油酸、亚油酸、亚麻酸的氧化，可能途径是脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）催化这些脂肪酸的C9和C10之间双键，形成C10氢过氧化物，再断裂。LOX具有催化位置特异性，以花生四烯酸为底物，可分为9-、12-、15-LOX等；不同鱼中LOX有一定差异，如本实验室前期发现白鲢鱼肉中的LOX主要是12-LOX；草鱼肉中LOX已有大量报道，但还鲜有研究鉴定其底物特异性，本实验结果提示，草鱼肉中LOX可能主要是9-LOX。

图6 冷藏对草鱼肉中脂肪酸、氨基酸的影响Fig. 6 Effect of cold storage on fatty acids and amino acids in grass carp muscle

氨基酸的组成也会对鱼肉的风味造成影响。草鱼肉冷藏72 h，氨基酸中的差异代谢物只有缬氨酸和-半胱氨酸（＜0.05）（图3），冷藏期间缬氨酸和-半胱氨酸含量随时间延长显著增加（图6C、D）。不同肉类冷藏过程中氨基酸含量变化规律不同，如冷藏鸭肉中鹅肌肽含量随冷藏时间延长而显著增加，但牛磺酸含量显著降低；冷藏河蚌肉中支链氨基酸和丙氨酸含量显著增加，牛磺酸含量显著降低（＜0.05）；冷藏鸡肉中肌肽、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸含量随着冷藏时间延长而减少，而色氨酸和鸟氨酸含量分别在贮藏0～2 d和0～4 d增加，随后才减少。肉类贮藏过程中氨基酸的增加主要源自内源蛋白酶催化降解蛋白质，溶酶体组织蛋白酶是鱼肉蛋白质降解的主要蛋白酶，主要降解低分子质量的肌原纤维蛋白。

如图6所示，亚麻酸、花生四烯酸含量在0～24 h内即显著降低，缬氨酸和-半胱氨酸含量在24～72 h才显著增加；其可能机制是冷藏草鱼肉中脂肪先发生氧化降解产生ROS，ROS的大量累积导致溶酶体失稳，释放组织蛋白酶，降解鱼肉蛋白。冷藏牦牛肉、白鲢鱼溶酶体的研究也表明，膜脂质氧化、降解是溶酶体失稳的主要原因之一。溶酶体中含有大量低分子质量活性铁，ROS可以在细胞膜上自由扩散，然后与亚铁离子相互作用，发生芬顿反应，从而产生更多的ROS如羟自由基，参与脂质氧化链式反应，加速鱼肉的脂肪氧化进程。

2.2.5 冷藏对草鱼肉中ATP代谢的影响

ATP的降解代谢途径对鱼肉品质形成有重要影响。ATP降解产物ADP、AMP、IMP都具有鲜味，特别是IMP，是鱼肉鲜味的主要呈味物质，而进一步降解的产物HxR、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）、黄嘌呤都有苦味，对鱼肉滋味有负面影响。值为ATP降解产物HxR和Hx在ATP系列分解产物（ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx）含量中的占比，是评价鱼肉新鲜度的重要指标。草鱼肉中ATP含量在冷藏24 h内下降到低于检出限（数据未列出），从图7可看出，AMP含量在冷藏24 h内快速降低（＜0.05），与文献[23]中鱼肉ATP含量较低，一般在宰后1～2 d消耗殆尽的报道一致；冷藏72 h期间，IMP含量在300～450 mg/kg，与文献[29]报道基本一致；HxR含量显著增加（＜0.05），从约2 g/kg增加到约22 g/kg，而Hx含量低于检出限。不同鱼肉宰后HxR和Hx的累积有显著差异，并一般以其中一种为主，如比目鱼、多线鱼主要累积Hx，平鮋和太平洋鳕鱼主要累积HxR，本实验结果表明，草鱼主要累积HxR。

图7 冷藏对草鱼肉中ATP代谢物的影响Fig. 7 Effect of cold storage on ATP metabolites in grass carp muscle

HxR可由IMP在磷酸酶催化下脱磷酸生成，也可由腺苷在腺嘌呤脱氨酶催化下生成。冷藏72 h鱼肉中，HxR含量是IMP、磷酸的几十倍，是AMP、ADP、ATP的几百倍，表明冷藏草鱼肉中HxR的主要来源可能不是ATP降解，而是其他途径。DNA、RNA、NAD、NADP等降解均可产生腺苷，腺苷再脱氨基转化为HxR，草鱼肉中DNA、RNA总含量只有1.5 g/kg左右，NAD、NADP含量均可以达到10 g/kg以上，所以草鱼肉中HxR的主要来源更可能是NAD和NADP降解，这需要进一步实验验证。NAD和NADP降解率和贮藏时间呈正相关，即源于NAD和NADP降解的HxR累积量与贮藏时间呈正相关，所以，即使HxR主要源于NAD和NADP降解，也不影响值作为鱼肉新鲜度指标。

HxR在黄嘌呤氧化酶催化下，转化成Hx，但本实验样品中Hx含量低于检出限，推测是黄嘌呤氧化酶活性被抑制。根据代谢组学测定结果，草鱼肉中含有胡椒碱、柚皮素、马钱子苷等植物次级代谢物；文献[32-33]报道植物次级代谢物（如生物碱、植物多酚）可抑制黄嘌呤氧化酶活性。本实验进一步通过分子对接模拟方法分析草鱼肉中检测到的植物次级代谢物与黄嘌呤氧化酶的相互作用，如表1所示，胡椒碱、柚皮素、茉莉酸甲酯、马钱子苷、-蛔蒿素、枞酸、3,4-二羟基扁桃酸、松香酸与黄嘌呤氧化酶结合能分别是-38.2、-34.4、-23.1、-29.4、-36.5、-36.5、-27.3、-20.2 kJ/mol，一般而言，结合能小于-21 kJ/mol表明配体与受体之间可形成稳定的复合物；特别是马钱子苷、3,4-二羟基扁桃酸与黄嘌呤氧化酶的对接位点位于黄嘌呤催化活性口袋附近（图8）；所以，胡椒碱、柚皮素、茉莉酸甲酯、马钱子苷、-蛔蒿素、枞酸、3,4-二羟基扁桃酸可能对黄嘌呤氧化酶有较强的抑制作用，这可能也是HxR含量较高的原因之一。

表1 冷藏草鱼中植物次级代谢物与黄嘌呤氧化酶的Vina对接结合能Table 1 Vina docking binding energy of plant secondary metabolites with xanthine oxidase in refrigerated grass carp

图8 黄嘌呤氧化酶与马钱子苷（A）、3,4-二羟基扁桃酸（B）分子对接情况Fig. 8 Molecular docking of xanthine oxidase with loganin (A) and 3,4-dihydroxymandelic acid (B)

3 结 论

本实验采用GC-TOF-MS和透射扫描显微镜分析了草鱼肉4 ℃冷藏0、24、72 h后代谢物组、超微结构的变化。透射扫描显微镜结果显示新鲜鱼肉肌节清晰、整齐，肌纤维间隙较小；随着冷藏时间延长，肌纤维间隙变大、排列散乱，部分肌节断裂。代谢组学共鉴定到211 种代谢物，识别出42 种差异代谢物；通过分析这些代谢物在冷藏过程中的含量变化发现，冷藏过程中，草鱼肉中琥珀酸含量显著减少，4-HB、GABA含量显著增加，可能是检测冷藏草鱼肉新鲜度的潜在指标；脂肪氧化降解先于蛋白质降解；草鱼肉含有的胡椒碱、柚皮素、马钱子苷等植物次级代谢物可能可通过抑制黄嘌呤氧化酶影响鱼肉核苷酸代谢及鱼肉滋味。