热处理对豌豆分离蛋白结合典型牛肉香气物质的影响及相互作用机制

徐思佳，毕 爽，张文涛，潘 鑫，劳 菲，沈 群，吴继红,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，农业农村部果蔬加工重点实验室，食品非热加工北京市重点实验室，北京 100083；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

在“双碳”目标的指导下，科学膳食和健康中国的理念深入人心，人们对于植物性食品的需求不断增加。豌豆具有蛋白质含量高（233～267 g/kg）和脂肪含量低（15～20 g/kg）的特点，目前作为植物肉生产原料而被广泛关注与应用。植物肉中的肉香通常需要外添香精、水解动物或植物蛋白液、产生肉香的前体物质。天然的肉香由肌肉组织在受热中产生，低阈值的含硫、含氧、含氮杂环化合物及不饱和醛是肉香味的关键香气成分，对肉香味贡献较大，本研究所选择的香气物质2-甲基吡嗪、2-甲基-3-巯基呋喃、(,)-2,4-癸二烯醛和5-羟乙基-4-甲基噻唑均是熟牛肉的关键风味物质。蛋白质不会直接影响风味，但可与挥发性风味物质发生可逆或不可逆结合，从而影响香气协调性。因此，在植物肉制品中模拟真实的肉类风味或产生特定的肉类风味，必须考察蛋白质对挥发性风味物质的结合情况。

现有研究主要集中在天然豌豆蛋白与挥发性风味物质的相互作用，Wang Kun等发现豌豆分离蛋白结合醛类挥发性风味物质的能力强于其与酮类物质的结合，本实验室前期研究发现天然豌豆蛋白与3 种豌豆关键香气物质（()-2-戊烯-1-醇、正己醛和()-2-辛烯醛）之间通过氢键和疏水相互作用结合，但是这些研究没有考虑到实际加工对风味的影响。热处理是蛋白质食品加工的必要工艺，影响挥发性风味物质在蛋白质中的保留和释放。此外，目前对于植物源蛋白的研究多集中在其与呈果香的短链醛、酮、酯类羰基化合物的结合情况，而与呈肉香的含氮、含硫杂环化合物和不饱和醛的研究有限。

本实验以豌豆分离蛋白和4 种典型牛肉风味物质（2-甲基吡嗪、2-甲基-3-巯基呋喃、(,)-2,4-癸二烯醛和5-羟乙基-4-甲基噻唑）为研究对象，探究热处理对豌豆分离蛋白与典型牛肉香气物质结合情况的影响，分析香气结合率变化与香气物质性质、豌豆蛋白性质的关联性，明确相互作用机理，以期对植物肉生产热加工过程中的风味调控与修饰提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆（L.），2021年收获的‘中豌’系列品种，购于山西东方亮生命科技股份有限公司。

2-甲基吡嗪（纯度≥99%）、2-甲基-3-巯基呋喃（纯度≥95%）、(,)-2,4-癸二烯醛（纯度≥89%）、8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS，纯度≥97%） Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；5-羟乙基-4-甲基噻唑（纯度＞98%） 梯希爱化成工业发展有限公司；其他化学试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）仪、DB-WAX气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent有限公司；固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS，2 cm） Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；CNW 18 mm螺纹口20 mL棕色圆底顶空样品瓶 上海安谱实验科技股份有限公司；Carry-50荧光分光光度计 美国Varian公司；ZEN 3700粒度分析仪 英国Malvern仪器有限公司；RET BASIC S025加热磁力搅拌器 艾卡（广州）仪器设备有限公司（IKA中国）；JJ-1増力电动搅拌器 北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆分离蛋白的提取

参考Cui Leqi等方法并稍作调整，豌豆磨粉后过60 目筛，以1∶10（/）的比例加入超纯水，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，采用电动搅拌器搅拌1 h后10 000×离心15 min，收集上清液并使用2 mol/L HCl溶液调节pH值至4.5，搅拌1 h后10 000×离心15 min，弃去上清液并用超纯水洗涤沉淀2 次，然后用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0，将样品转移至透析袋（7 kDa）中，4 ℃下透析48 h，每6 h更换一次超纯水，将透析后的样品冷冻干燥得到豌豆分离蛋白。经凯氏定氮法测定，提取物中蛋白质相对含量为（90.15±1.20）%。

1.3.2 SPME-GC-MS法测定香气结合率

使用KHPO-KHPO缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.6）配制质量浓度10 mg/mL豌豆分离蛋白溶液，磁力搅拌12 h使蛋白充分溶解。以甲醇（色谱级）为溶剂配制0.01 mol/L香气储备液，每次实验前，使用上述磷酸钾缓冲液稀释，使得2-甲基吡嗪、2-甲基-3-巯基呋喃、(,)-2,4-癸二烯醛的质量浓度为40 mg/L，5-羟乙基-4-甲基噻唑的质量浓度为220 mg/L。在20 mL顶空瓶中，加入1 mL豌豆分离蛋白溶液、0.5 mL香气稀释液和0.5 mL磷酸钾缓冲液，混合后立即旋紧螺旋盖。然后在各热处理条件下处理样品，其中探究热处理温度影响的实验条件为80、90、100、120 ℃下热处理10 min；探究热处理时间影响的实验条件为100 ℃下热处理5、10、15、20 min；同时设置对照组不进行热处理。热处理结束后立即将顶空瓶放入冰水中降温，然后在25 ℃下恒温振摇12 h使之达到平衡状态，采用GC-MS测定顶空香气峰面积。

参考宋泽等的方法并稍作调整。顶空固相微萃取条件：顶空瓶于50 ℃平衡10 min并振荡，平衡结束后SPME萃取头插入顶空部分吸附30 min，然后在250 ℃解吸附5 min。GC条件：载气为高纯度氦气（99.999%），流速1.0 mL/min，从顶空吸取1 mL气体进入GC进样口，不分流，进样口温度250 ℃，程序升温条件为起始温度40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升温至220 ℃，在220 ℃保持2 min。MS条件：电子轰击离子源，电子能量70 eV，离子源、辅助热处理器温度和四极杆温度分别为230、250 ℃和150 ℃。在全离子扫描模式下确定2-甲基吡嗪的特征/为94、67、26、39和40，2-甲基-3-巯基呋喃的特征/为114、113、85、45和43，(,)-2,4-癸二烯醛的特征/为81、41、67、83和55，5-羟乙基-4-甲基噻唑的特征/为112、113、45、143和85，在选择离子扫描模式下定量。豌豆分离蛋白与香气物质结合率计算如式（1）所示。香气物质自身的属性参数查阅于https://www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx。

1.3.3 表面疏水性测定

采用ANS法测定蛋白表面疏水性。用KHPO-KHPO缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.6）分别配制质量浓度0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mg/mL的豌豆分离蛋白溶液，热处理后各取4 mL分别加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液，在25 ℃避光静置5 min后测定荧光强度，荧光测定条件为激发波长390 nm，发射波长470 nm，发射光谱范围为430～520 nm，狭缝为1 nm，分度为0.5 nm。以蛋白质量浓度为自变量、荧光强度为因变量进行线性拟合，斜率即为表面疏水性。

1.3.4 粒径和ζ电位测定

豌豆分离蛋白溶液热处理后用KHPO-KHPO缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.6）稀释至质量浓度1 mg/mL，然后通过粒度分析仪测定粒径和ζ电位。相对折射率取1.330。

1.3.5 荧光光谱测定

参考Shen Hui等方法并稍作调整，配制待测溶液，使豌豆分离蛋白质量浓度为1 mg/mL，2-甲基吡嗪浓度为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mmol/L，用KHPO-KHPO缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.6）补充体积至5 mL。以不加热为对照组，热处理组在100 ℃下加热10 min，然后分别在25、30、37 ℃下以100 r/min恒温振荡2 h，使蛋白与2-甲基吡嗪充分相互作用，2 h后立即测定荧光强度。荧光测定条件为激发波长290 nm，发射波长330 nm，发射光谱范围为300～450 nm，狭缝为2 nm，分度为0.5 nm。使用Stern-Volmer方程（式（2））分析荧光数据。

式中：和分别表示不存在和存在2-甲基吡嗪（猝灭剂）时的荧光强度；[]为2-甲基吡嗪浓度/（mol/L）；为Stern-Volmer猝灭常数/（L/mol）。

采用Stern-Volmer方程的变形公式（式（3））进一步计算有效猝灭常数/（L/mol）。

式中：为可猝灭荧光的常数。

由于/Δ与1/[]呈线性关系，所以可以通过斜率和截距计算得到。当温度变化很小时，焓变Δ可视为常数，Δ和熵变Δ分别通过Van’t Hoff方程（式（4））的斜率和截距计算得到。

式中：为气体常数（8.314 kJ/（mol·K））；为平衡温度/K，即恒温振荡温度。

吉布斯自由能Δ/（kJ/mol）根据式（5）计算。

1.3.6 SPME-GC-MS测定豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪的结合常数

在20 mL顶空瓶中，豌豆分离蛋白质量浓度5 mg/mL，2-甲基吡嗪浓度为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L，用KHPO-KHPO缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.6）补充体积至2 mL。以不加热为对照组，热处理组在100 ℃下加热10 min，SPME-GC-MS检测条件参考1.3.2节。采用Scatchard模型描述平衡条件下挥发性风味化合物与蛋白质的结合，结合位点数和结合常数按式（6）、（7）计算。

式中：为单位物质的量蛋白结合挥发性风味化合物的物质的量；[]为样品溶液中总挥发性风味物质浓度/（mol/L）；为豌豆蛋白浓度/（mol/L）；为结合位点数；为结合常数/（L/mol）；[]为溶液中挥发性风味化合物的游离浓度/（mol/L）；为描述单个结合位点和风味配体间协同特性的Hill系数，当＝1时公式（6）为Klotz方程，在Klotz方程中常用值衡量整体结合亲和力。

1.4 数据处理与分析

所有实验设置3 个平行，结果以平均值±标准差表示，利用SPSS v.26.0软件进行单因素方差分析（＜0.05）、协方差分析和Spearman相关性分析，利用Origin 2022软件绘图。

2 结果与分析

2.1 热处理对豌豆分离蛋白与香气物质结合率的影响

2.1.1 热处理温度

热处理温度对豌豆分离蛋白与牛肉香气物质结合率的影响如图1所示，在常温下，2-甲基-3-巯基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛与豌豆分离蛋白的结合率大于98%，能充分地与豌豆分离蛋白结合，并且热处理对结合率的影响不大，这种现象可能是由于香气物质与豌豆分离蛋白发生强相互作用，这与香气物质的官能团有关。然而对于2-甲基吡嗪和5-羟乙基-4-甲基噻唑，温度升高对结合率的影响表现出相反的趋势。2-甲基吡嗪在常温时与豌豆分离蛋白的结合率为（17.58±0.58）%，提高温度导致结合率小幅升高，100 ℃的结合率相比常温增加了约7%；而5-羟乙基-4-甲基噻唑在常温时与豌豆分离蛋白的结合率为（80.34±7.68）%，且结合率随着温度升高而降低，在100 ℃的结合率相比常温降低了约26%。对于2-甲基吡嗪，蛋白质可能由于热变性暴露更多的结合位点，因此结合率升高。而对于5-羟乙基-4-甲基噻唑，温度升高会增加香气物质的活性系数，有利于解吸附，使逸散到顶空的香气物质含量更高，这是温度直接影响的结果。因此，挥发性风味化合物的保留或释放取决于热处理过程中蛋白质构象变化和香气化合物逸散的竞争结果。

图1 热处理温度对豌豆分离蛋白与牛肉香气物质结合率的影响Fig. 1 Effect of heat treatment temperature on the binding rates of pea protein isolate to beef aroma substances

在120 ℃下处理10 min后，豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪的结合率相比常温大幅提高了约32%，与5-羟乙基-4-甲基噻唑的结合率略低于常温下的结合率，但是高于80～100 ℃的结合率，表明120 ℃处理能够促进豌豆分离蛋白结合牛肉香气物质。在加工过程中，香气物质与蛋白基质紧密结合得以保留，而在咀嚼时从食物中释放，增强香气物质与蛋白基质的可逆结合有利于减少加工过程中的风味损失。

2.1.2 热处理时间

热处理时间对豌豆分离蛋白与牛肉香气物质结合率的影响如图2所示。热处理时间对2-甲基-3-巯基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛与豌豆分离蛋白的结合率影响不大，这是由于这两种香气物质与蛋白发生了强相互作用。2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白的结合率随着热处理时间的延长而升高，在100 ℃加热10 min后结合率为（25.35±1.26）%，经过15 min热处理后相比常温时的结合率增加了约12%，这可能是由于热处理过程中蛋白质结构展开，暴露的疏水基团对2-甲基吡嗪具有亲和力，而热处理20 min与热处理15 min没有显著差异（＞0.05），说明结合已经达到平衡。Damodaran和Wang Kun等研究了挥发性风味物质与大豆蛋白和豌豆蛋白结合的热力学，发现这种相互作用在热力学上是有利的和自发的。

图2 热处理时间对豌豆分离蛋白与牛肉香气物质结合率的影响Fig. 2 Effect of heat treatment time on the binding rates of pea protein isolate to beef aroma substances

豌豆分离蛋白与5-羟乙基-4-甲基噻唑的结合率在经过5 min热处理后相比常温时下降了约44%，随着热处理时间继续延长，结合率上升，在100 ℃加热10 min后结合率为（54.41±4.14）%，在经过20 min热处理后，结合率上升到略高于常温。推测大量5-羟乙基-4-甲基噻唑在受热后更易于逸散到顶空，其逸散分子数量大于与蛋白结合分子数量；随着热处理持续进行，豌豆蛋白结构展开，5-羟乙基-4-甲基噻唑与豌豆分离蛋白暴露的内部基团结合，逸散与结合逐渐达到平衡。

2.2 香气物质性质对结合率的影响

热处理对豌豆分离蛋白与2-甲基-3-巯基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛结合的影响不大，这可能是由于这两种香气物质能与蛋白质的官能团发生反应紧密结合，热处理不会破坏这种结合。4 种典型牛肉香气物质的性质如表1所示。

表1 4 种典型牛肉香气物质的性质Table 1 Properties of four typical beef aroma substances

2-甲基-3-巯基呋喃含有巯基，可与蛋白质发生强相互作用。有研究发现-乳球蛋白与含巯基的丙硫醇、呋喃-2-甲硫醇和苯硫酚之间通过共价键结合，形成二硫和三硫加合物。(,)-2,4-癸二烯醛是不饱和醛，相比于饱和醛，不饱和醛所含的醛基可以与蛋白的官能团发生强相互作用，形成不可逆的共价键。烯烃醛可与蛋白质的酰胺侧链形成席夫碱，也可与游离半胱氨酸硫醇发生共轭加成，热处理会促进这些反应。由于共价结合是不可逆的，因此以上香气物质与蛋白质的共价结合会导致香气损失和食品保质期缩短，只有香气物质通过非共价力与蛋白质相互作用，才有利于在加工过程中蛋白基食物风味特征的保留。

常温下，2-甲基吡嗪和5-羟乙基-4-甲基噻唑含有杂环，结构紧密且刚性强，较大的空间位阴限制其与豌豆分离蛋白发生疏水相互作用，而具有柔性链结构的(,)-2,4-癸二烯醛可以改变自身结构从而更容易与位点结合。通过核磁共振和X射线衍射等精确方法也证明了具有紧密分子结构的风味小分子物质很难与蛋白质内部疏水区域结合。

log表示油水分配系数或者疏水系数，log值越大，说明该物质越亲油，反之则说明该物质越亲水。豌豆分离蛋白与4 种牛肉香气物质的结合率与log值呈正相关，log值最小的2-甲基吡嗪表现与豌豆分离蛋白的结合率最低，随着4 种牛肉香气物质log值的升高，结合率也升高，log值较大的2-甲基-3-巯基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛能够与豌豆分离蛋白基本完全结合，这说明牛肉香气物质可能与豌豆分离蛋白的疏水性结合位点结合，表明相互作用本质上是疏水的。研究发现，对于属于同系物的挥发性风味物质，碳链越长，其被蛋白质保留的效果越强，这也说明香气物质的疏水性与其和蛋白的结合率呈正相关。

2.3 豌豆分离蛋白热变性对结合率的影响

2.3.1 表面疏水性

ANS可作为疏水性荧光探针，衡量所结合蛋白质位点的极性变化，进一步推测蛋白质结构变化。如图3A所示，随着处理温度升高到100 ℃，豌豆分离蛋白的表面疏水性增加到最大。表面疏水性的增加与蛋白质去折叠有关，热处理使得豌豆7S球蛋白展开，11S球蛋白亚基间二硫键断裂，导致埋藏在内部的非极性氨基酸侧链暴露。然而，120 ℃热处理和100 ℃延长热处理时间（图3B）均导致表面疏水性略有下降，表明疏水残基不再暴露，倾向于聚集。

图3 热处理对豌豆分离蛋白表面疏水性的影响Fig. 3 Effect of heat treatment on surface hydrophobicity of pea protein isolate

疏水基团暴露通常会增加与香气物质的结合，在本研究中最典型的是2-甲基吡嗪，在80～100 ℃加热10 min和100 ℃加热5～10 min的过程中，豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪的结合率随着其表面疏水性的升高而升高。对于log值同样较低的5-羟乙基-4-甲基噻唑，豌豆分离蛋白与其结合率与表面疏水性呈强负相关（＝-0.89），这说明经过加热，5-羟乙基-4-甲基噻唑的逸散效应强于蛋白与其的结合作用，因此结合率降低。

2.3.2 粒径和ζ电位

如图4A、B所示，经热处理后，豌豆分离蛋白粒径相比常温时（对照组）显著下降（＜0.05），且随热处理温度升高，豌豆分离蛋白粒径不断降低，这表明热处理诱导了蛋白四级结构的解离；而随热处理时间的延长，豌豆分离蛋白粒径无显著变化。蛋白在溶液中稳定时，其ζ电位绝对值不低于30 mV。如图4C、D所示，随着处理温度升高和时间延长，ζ电位略微升高，但依然在-30 mV附近，说明体系相对稳定，蛋白质不会大量聚集。在低离子浓度和低离子强度下，游离亚基很难形成聚集体，同样在本实验缓冲液体系中离子强度较低，豌豆蛋白亚基之间相互作用阴止聚集。在80 ℃时豌豆11S球蛋白虽然没有完全变性，但为了适应温度升高结构变得更加紧密，当温度继续升高，热变性豌豆7S球蛋白和伴豌豆球蛋白引起的空间位阴和静电排斥均通过非共价键作用减少变性豌豆11S球蛋白的聚集。

图4 热处理对豌豆分离蛋白粒径和ζ电位的影响Fig. 4 Effect of heat treatment on particle size and zeta potential of pea protein isolate

豌豆分离蛋白和2-甲基吡嗪的结合率与热处理温度（＝1.00）和热处理时间（＝0.90）呈极强正相关，与粒径呈极强负相关（＝-0.96）。当从常温升高到100 ℃时，豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪的结合率上升，此过程中豌豆分离蛋白表面疏水性也上升，表明热处理可能导致与2-甲基吡嗪的结合位点暴露。而对于5-羟乙基-4-甲基噻唑，在120 ℃和较长热处理时间下豌豆分离蛋白表面疏水性和粒径均降低，说明剧烈的热处理导致蛋白结构被严重破坏，可能暴露出有利于结合5-羟乙基-4-甲基噻唑的位点。

2.4 豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪的相互作用机制

吡嗪类化合物是对炖煮牛肉香气有重要贡献的杂环类化合物，同时也是美拉德反应的主要产物，在常温下其与豌豆分离蛋白的结合率较低，经过加热后有所提高，这说明2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白之间可能存在弱相互作用，因此选择2-甲基吡嗪作为模型香气物质，研究香气物质与豌豆分离蛋白相互作用机制。

2.4.1 Stern-Volmer方程分析荧光猝灭和相互作用类型

豌豆分离蛋白在330 nm附近有一个强烈的荧光发射峰，2-甲基吡嗪可以作为猝灭剂在不同浓度下逐渐降低豌豆分离蛋白的荧光，从而反映蛋白质构象改变引起的微环境变化或者分子结合情况。使用Stern-Volmer方程分析荧光数据，可以判断蛋白质与小分子间的荧光猝灭机制（＞0.98）。通常，动态猝灭和静态猝灭可以通过对温度的依赖性区分。如表2所示，随着升高而降低，说明2-甲基吡嗪对天然豌豆分离蛋白和热变性豌豆分离蛋白的荧光猝灭类型均为静态猝灭。

为了解热处理前后豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪的相互作用力，通过Stern-Volmer方程变形公式（＞0.99）和Van’t Hoff方程（＞0.93）线性拟合计算热力学参数。如表2所示，Δ＜0说明相互作用过程是自发的，热处理前后的Δ＜0且Δ＜0，说明2-甲基吡嗪与天然豌豆分离蛋白和热变性豌豆分离蛋白相互作用均为范德华力和氢键，并且为焓驱动反应。

表2 热处理前后2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白相互作用的Stern-Volmer常数和热力学参数Table 2 Stern-volmer constants and thermodynamic parameters of interaction between 2-methylpyrazine and pea protein isolate before and after heat treatment

2.4.2 Klotz方程分析结合参数

如图5所示，热处理前后2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白的结合规律符合Klotz方程，这种线性关系表明2-甲基吡嗪可独立地与豌豆分离蛋白结合，并且配体和蛋白质之间是非共价相互作用。如表3所示，豌豆分离蛋白经热处理后，与2-甲基吡嗪的结合位点数从20.46±15.69升高到23.78±15.12，Suppavorasatit等发现不同温度下麦芽酚与大豆分离蛋白的结合位点数不同，说明结合位点数与蛋白质的分子结构密切相关。热处理后豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪结合常数从（638.63±490.36）L/mol升高到（961.97±612.93）L/mol，这与热处理后2-甲基吡嗪结合率升高的结果一致。单独使用或不能代表挥发性风味物质与蛋白质的整体结合力，值可以更准确地衡量整体结合亲和力。经过热处理后，值从（13 065.25±546.63）L/mol升高到（22 876.70±985.48）L/mol，进一步说明加热使豌豆分离蛋白结合2-甲基吡嗪的能力增强。

图5 热处理前后2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白相互作用的Klotz双倒数图Fig. 5 Klotz double reciprocal plot of interaction between 2-methylpyrazine and pea protein isolate before and after heat treatment

表3 热处理前后2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白的结合参数Table 3 Binding parameters of 2-methylpyrazine to pea protein isolate before and after heat treatment

挥发性风味物质与豆类蛋白的结合位点可能位于亚基的界面之间或者疏水表面，其中位于亚基界面的结合位点数少且结合常数较大。Guo Jun等测得大豆分离蛋白与香气物质的高亲和力一级结合位点数范围为1～2、结合常数范围为14 000～20 000 L/mol，而低亲和力的二级结合位点数范围为1～11、结合常数范围为100～1 500 L/mol，对比可知，2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白的结合位点数较多且结合常数较小，推测2-甲基吡嗪与豌豆分离蛋白的结合位点位于疏水表面。加热使豌豆分离蛋白结构去折叠，并且未发生聚集，蛋白质表面暴露出更多疏水性基团，同时加热后使豌豆分离蛋白与2-甲基吡嗪的结合率升高，因此推测加热后2-甲基吡嗪的结合位点也位于豌豆分离蛋白疏水表面。此外，由于2-甲基吡嗪具有环状结构，因此空间位阴较大，难以进入蛋白内部的疏水空腔，因此更易结合在疏水表面。

3 结 论

本实验采用GC-MS、荧光光谱等方法分析热处理对豌豆分离蛋白结合典型牛肉香气物质的影响，探究了结合率与香气物质和蛋白性质的相关性，明确了豌豆分离蛋白和2-甲基吡嗪的相互作用机理。研究发现，疏水系数（log）较大的2-甲基-3-巯基呋喃和(,)-2,4-癸二烯醛与豌豆分离蛋白的结合率在常温和热处理后均大于98%，结合率不受加热影响。常温下5-羟乙基-4-甲基噻唑（（80.34±7.68）%）和2-甲基吡嗪（（17.58±0.58）%）与豌豆分离蛋白的结合率低于前2 种香气物质，随着温度升高，空间位阴较大的5-羟乙基-4-甲基噻唑的结合率降低，而低log的2-甲基吡嗪的结合率升高，经过120 ℃加热和延长加热时间后，这2 种香气物质与豌豆分离蛋白的结合均增强。天然和热变性豌豆分离蛋白和2-甲基吡嗪的相互作用力均为氢键和范德华力，荧光猝灭机制为静态猝灭，为焓驱动反应，2-甲基吡嗪在豌豆分离蛋白的结合位点位于蛋白疏水表面。热处理使蛋白内部疏水基团暴露，四级结构解离，并且在低离子浓度和低离子强度下不再聚集，导致位于疏水表面的2-甲基吡嗪结合位点暴露增加，促进豌豆分离蛋白结合2-甲基吡嗪。本研究结果对更好地理解热处理下豌豆蛋白基植物肉中牛肉香气物质结合的变化及指导工艺开发具有重要意义。