低频静磁场对发芽玉米酚类物质富集及降糖活性的影响

方晓敏，任世达，贾 睿，刘倩男，蔡 丹，刘景圣

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林 长春 130118）

玉米籽粒富含蛋白质、脂肪、维生素、酚类物质等活性物质，具有开发成为高营养功能食品的巨大潜力。酚类物质是玉米中重要的活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂等生理活性。发芽是一种简单、有效的处理方法，可以提高谷物的活性物质含量，目前常用于辅助发芽的非热物理技术有多色光辐照、非热等离子体、脉冲电场等，其中磁场作为一种简单、高效且对植物组织伤害小的方法，受到大量研究人员的关注。

研究表明植物酚类物质代谢的主要途径有莽草酸、苯丙烷代谢途径，其中苯丙烷代谢途径主要作用的酶有苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酰-辅酶A连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）等，酚类物质的合成与这些酶密切相关。磁场作为一种外界物理条件处理方法，可以增强细胞内酶活性，促进种子萌发和生长，现有研究报道，棕榈种子在磁场强度9 mT下处理4 h后，其发芽率显著高于对照组；向日葵种子在磁场强度50 mT下处理2 h后，发芽速度、幼苗长度和幼苗干质量达到峰值，与对照组相比，磁场处理向日葵种子的-淀粉酶、脱氢酶和蛋白酶的活性显著增强；大豆和玉米在200 mT静磁场条件下处理1 h，可以有效缓解盐胁迫对种子萌发的抑制；番茄种子、鹰嘴豆、洋葱等其他作物在磁场作用下，种子萌发速率也得到显著提高。目前磁场处理发芽的相关研究主要集中在植物的生理变化上，对其活性成分酚类物质及其降糖效果的研究报道较少。

本实验以玉米（‘吉单66’）为原料，采用不同时间、磁场强度处理，研究低频静磁场对发芽玉米的生长情况、总酚含量、酚酸组成及降糖活性的影响，以及多酚代谢关键酶PAL、C4H、4CL活力的变化，旨在揭示磁场处理对发芽玉米中酚类物质富集的作用机理，为发芽玉米产品的开发提供必要的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马齿形黄玉米‘吉单66’（2020年10月份成熟采摘）由吉林农业大学小麦和玉米深加工国家工程实验室提供。

没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸、丁香酸、邻香豆酸酚酸标准品（纯度≥97%） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、冰乙酸（均为色谱纯）以及-葡萄糖苷酶（10 U/g）、-淀粉酶（10 U/g） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

植物生长箱 德国Binder公司；FLUO star Omega全自动多功能酶标仪 德国BMGLabtech公司；Z36HK超高速冷冻离心机 德国Hermle公司；磁场催化光照培养箱MFOI-L1 英都斯特（无锡）感应科技有限公司；FD-IB-50冷冻干燥机 北京博医康仪器有限公司；高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 磁场处理发芽

取籽粒饱满的玉米，用体积分数1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒30 min，然后用蒸馏水冲洗后浸泡6 h，将其放在磁场两极之间，在磁场强度为2.5、3.5、4.5 mT条件下分别放置12、24、36、48、60、72 h，然后将玉米籽粒均匀放入规格为34 cm×25 cm×4.5 cm的发芽盘中，每盘放100 粒，加入1 000 mL水，放入植物生长箱中25 ℃避光发芽至第4天取样（通过预实验发现玉米在发芽第4天时酚类物质含量最高），每12 h换水一次，以未经磁场处理发芽至第4天的玉米作为对照组，将样品进行冷冻干燥处理，研磨成粉后待测。

1.3.2 生长指标测定

发芽率：测定100 粒玉米的发芽情况，种子出现肉眼可见的胚根萌芽时，且无霉变污染情况，则视为发芽。芽长：随机取10 粒玉米，用游标卡尺测量芽长，计算平均值。鲜质量：随机选取10 粒玉米，用精密电子天平称质量，计算平均值。上述实验均做3 次平行。

1.3.3 多酚的提取

游离酚的提取：参照Okarter等的方法，称取2 g发芽玉米粉，加入60 mL体积分数为70%的乙醇溶液，在超声波辅助的条件下提取45 min，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，重复上述操作步骤2 次，45 ℃旋转蒸发至干，用5 mL甲醇溶解备用。

结合酚的提取：参照李艳等的方法，向上述提取游离酚剩下的残渣中加入40 mL 2 mol/L NaOH溶液，在25 ℃摇床中振荡反应1 h，用6 mol/L HCl溶液调整pH值至2～3，最后用乙酸乙酯进行萃取，每个样品萃取3 次，合并上清液，置于旋转蒸发仪中旋蒸至干，用5 mL甲醇溶解备用。

1.3.4 多酚含量测定

多酚含量测定参考Luo Jiaqiang等的方法并稍作修改。精确吸取50 μL发芽玉米多酚提取液，依次加入200 μL蒸馏水和250 μL福林-酚工作液，室温下避光静置5 min，然后加入250 μL质量分数10% NaCO溶液，室温下避光反应1 h，吸取200 μL反应液置于96 孔板中，使用酶标仪测定765 nm波长处的吸光度。选用系列质量浓度没食子酸为标准品进行上述处理，以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为＝0.005 7+0.074 6（＝0.999 1）。根据式（1）计算发芽玉米多酚含量。

式中：为发芽玉米粉多酚质量浓度/（mg/mL）；为提取液体积/mL；为稀释倍数；为发芽玉米粉质量/g。

1.3.5 酚酸含量测定

本实验选取没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸、丁香酸、邻香豆酸6 种酚酸类物质进行分析，这些酚酸类物质是苯丙烷途径代谢的关键酚类物质，采用高效液相色谱法对低频静磁场处理后发芽玉米中的酚酸类物质进行定性定量分析。色谱柱：Zorbox SBC柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），二极管阵列检测器，检测波长280 nm。流动相分别为体积分数0.5%的冰乙酸溶液（B相）和甲醇（A相），洗脱梯度：0～8 min，5%～8%流动相A；8～17 min，8%～10%流动相A；17～20 min，10%～12%流动相A；20～25 min，12%～15%流动相A；25～33 min，15%～22%流动相A；33～50 min，22%～50%流动相A。

1.3.6 PAL活力的测定

参考丁羽宣等方法测定PAL活力，以每分钟每克发芽玉米酶促反应体系290 nm波长处吸光度增加0.01为一个PAL活力单位（U）。

1.3.7 C4H活力的测定

参考Wang Mian等方法测定C4H活力，以每分钟每克发芽玉米酶促反应体系340 nm波长处吸光度增加0.01为一个C4H活力单位（U）。

1.3.8 4CL活力的测定

参考Wei Yingying等方法测定4CL活力，以每分钟每克发芽玉米酶促反应体系340 nm波长处吸光度增加0.01为一个4CL活力单位（U）。

1.3.9 发芽玉米酚类物质体外降糖活性的测定

1.3.9.1 酚类物质对-葡萄糖苷酶活性抑制率的测定

参考Yang Xiaoping等方法并稍作修改。取40 μL浓度为0.1 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液，加入发芽玉米多酚提取液20 μL、0.4 U/mL-葡萄糖苷酶液10 μL，37 ℃保温10 min，再加入50 μL浓度为10 mmol/L的底物对硝基苯酚葡萄糖苷溶液，37 ℃反应20 min，最后加入0.2 mol/L NaCO溶液50 μL终止反应，在405 nm波长处测定反应体系吸光度。玉米多酚对-葡萄糖苷酶的抑制率按公式（2）计算。

式中：为10 μL-葡萄糖苷酶溶液+20 μL发芽玉米多酚提取液+50 μL底物+90 μL磷酸盐缓冲液的吸光度；为100 μL磷酸盐缓冲溶液+50 μL底物+20 μL发芽玉米多酚提取液的吸光度；为110 μL磷酸盐缓冲溶液+10 μL-葡萄苷酶溶液+50 μL底物的吸光度。

1.3.9.2 酚类物质对-淀粉酶活性抑制率的测定

参考乔锦莉等方法并稍作修改。取发芽玉米多酚提取液20 μL，加入20 μL-淀粉酶（7 U/L），混匀后在37 ℃水浴锅中预热30 min，加入40 μL预热到37 ℃的质量分数1%淀粉溶液，在37 ℃下反应3 min后加入80 μL DNS试剂，沸水浴8 min，冷却至室温后，加入800 μL蒸馏水稀释，在450 nm波长处测定吸光度，同时以20 μL蒸馏水替换发芽玉米多酚提取液作为对照。玉米多酚对-淀粉酶的抑制率按公式（3）计算。

式中：为不加发芽玉米多酚提取液的反应体系吸光度；为加入发芽玉米多酚提取液的反应体系吸光度。

1.4 数据处理与分析

使用Origin 2017软件绘图，使用SPSS 24软件对数据进行单因素方差分析，以＜0.05表示差异显著，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 低频静磁场处理对发芽玉米生长指标的影响

由图1可知，随着低频静磁场处理时间的延长，发芽玉米籽粒的芽长、发芽率、鲜质量总体都呈先增加后下降的变化趋势，3.5 mT下处理60 h后，发芽玉米芽长、发芽率达到最大，分别为（4.51±0.11）cm、96%，较对照组分别提高了32.65%、14.29%；3.5 mT下处理48 h后发芽玉米籽粒的鲜质量最大，为（1.49±0.04）g/粒，较对照组提高了34.23%（＜0.05）。玉米种子在磁场作用下，增加了细胞膜的渗透性，加快了水和氧气进入种子的速度，提高了呼吸氧化酶的活性，从而增强了胚的呼吸作用，因此促进了玉米籽粒的萌发，使玉米籽粒芽和根的长度增长；经磁场处理后的玉米种子根系更加发达，且侧根数量增多，使得种子吸水面积增大，吸水能力增强，所以种子的鲜质量被提高。但在磁场处理60 h后发芽玉米芽长、鲜质量都有所下降，可能是低频静磁场处理会产生临界效应，处理时间过长对玉米籽粒的生长产生了抑制作用。综上，适宜的磁场处理条件可以促进种子的生长。

图1 低频静磁场处理对发芽玉米生长指标的影响Fig. 1 Effect of low-frequency static magnetic field treatment on growth indexes of germinated maize

2.2 低频静磁场处理对发芽玉米游离酚、结合酚含量的影响

由图2可知，在静磁场的作用下，发芽玉米多酚含量显著提高，磁场处理前48 h内多酚含量增长幅度较小，在磁场强度3.5 mT下处理60 h后，游离酚和结合酚含量增加最多，分别为（4.15±0.09）mg/g和（1.33±0.06）mg/g，较对照组分别提高了47.16%和72.72%（＜0.05），说明磁场处理60 h富集多酚效果最佳，所以后续在磁场处理60 h进行酚酸含量的测定。这一结果与张茜等的研究结果相似，静磁场处理可以有效地富集酚类物质，种子经磁场处理后，多种酶被激活，使酶活力提高，促进了植物体内的代谢过程，从而保证有充足的养料，为酚类物质的富集提供了足够的物质基础和能量来源。

图2 低频静磁场处理对发芽玉米游离酚（A）、结合酚（B）含量的影响Fig. 2 Effect of low-frequency static magnetic field treatment on the contents of free (A) and bound (B) phenols in geminated maize

2.3 低频静磁场处理对发芽玉米酚酸组分的影响

多酚标准品高效液相色谱和回归方程分别如图3和表1所示。由表2可知，低频静磁场处理发芽玉米结合酚和游离酚含量变化存在明显差异。在游离酚中，丁香酸、对香豆酸、咖啡酸、邻香豆酸在磁场强度为3.5 mT时含量最高，分别为（206.72±8.26）、（753.20±10.25）、（235.06±4.39）、（382.03±13.14）μg/g，较对照组分别提高501.80%、149.25%、22.71%、2.42%；没食子酸在磁场强度为3.5～4.5 mT条件下，含量为（158.20±4.25）～（160.46±7.98）μg/g，差异不显著（＞0.05），但与对照组相比提高58.18%～60.44%（＜0.05）；阿魏酸含量与对照组相比显著下降。

表1 6 种酚类物质标准品的回归方程Table 1 Calibration curve equations for determination of six phenolic compounds

表2 低频静磁场处理对发芽玉米酚酸类物质组成和含量的影响Table 2 Effect of low-frequency static magnetic field treatment on the composition and content of phenolic acids in germinated maize

图3 多酚标准品高效液相色谱Fig. 3 High performance liquid chromatogram of polyphenol standards

在结合酚中，磁场处理后没食子酸、邻香豆酸含量较对照组相比均有所下降，丁香酸、对香豆酸在磁场强度4.5 mT条件下含量最大，分别为（188.24±5.24）μg/g和（387.01±6.15）μg/g，与对照组相比分别提高了492.32%、69.56%（＜0.05），阿魏酸和咖啡酸在磁场强度为3.5 mT时含量达到最大，分别为（211.85±6.34）μg/g和（332.68±5.32）μg/g，这可能是在种子发芽过程中受到多酚氧化酶、水解酶等影响，酚酸类物质与木素质交联，参与植物细胞壁的形成，产生更多酚酸类物质，从而影响其含量。

2.4 低频静磁场处理发芽玉米多酚含量及关键酶活力的变化关系

低频静磁场处理总酚含量及关键酶PAL、C4H、4CL活力变化情况如图4所示。由图4B可知，经3.5 mT低频静磁场处理后，总酚含量以及C4H、4CL活力随着处理时间的延长均呈先上升后下降的变化趋势，PAL活力变化趋势为上升-下降-上升。2.5、4.5 mT条件下，前36 h总酚含量以及3 种酶活力呈现波动变化，36 h后多酚含量与3 种代谢酶活力随着时间的延长总体呈先增加后下降的趋势，在磁场强度为3.5 mT下处理60 h后，总酚含量最高（（5.48±0.15）mg/g），此时PAL、C4H、4CL活力均达到最大值，分别为（496.67±14.21）、（64.68±2.22）、（97.56±3.64）U/g，经磁场处理后，发芽玉米总酚含量被提高，这与其代谢相关酶活力增强相关。磁场处理首先影响了作用于多酚苯丙烷代谢途径的第一限速酶PAL，使PAL活力提高，为后续多酚代谢产生足够的肉桂酸，进而提高了C4H活力，促进了对香豆酸的合成，为下一步咖啡酸、阿魏酸等酚酸类物质提供足够的前体物质，也为苯丙烷代谢途径中黄酮类物质的生成提供物质基础。这些多酚代谢关键酶活力提高的原因可能是酶的本质是蛋白质，蛋白质的空间结构由氢键、范德华力和离子键等来维持，磁场处理后，种子细胞中大量的带电离子和极性分子重新组合，加速酶分子氢键的合成，改变酶的空间结构，从而提高酶活力。此外，在静磁场的作用下，种子中的水分子和其他化合物水分子相互作用后产生超氧阴离子自由基，这种自由基可以使合成酶的基因活化，从而提高各种酶的活性和合成速度，进而改变植物代谢的速率。

图4 低频静磁场处理发芽玉米多酚含量及关键酶活力变化关系Fig. 4 Relationship between phenolic contents and key enzyme activities in germinated maize treated with low-frequency static magnetic field

2.5 低频静磁场处理对发芽玉米酚类物质降糖活性的影响

2.5.1 发芽玉米酚类物质对-葡萄糖苷酶活性的影响

由图5可知，低频静磁场处理后，发芽玉米游离酚对-葡萄糖苷酶活性的抑制作用明显高于结合酚，在磁场强度为3.5 mT条件下处理60 h，游离酚的-葡萄糖苷酶半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC）为（18.21±0.52）μg/mL，表明此时游离酚对-葡萄糖苷酶的抑制作用最大，3.5、4.5 mT条件下，结合酚的-葡萄糖苷酶IC与对照组比存在显著差异（＜0.05），在3.5 mT条件下处理60 h，结合酚对-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最大，IC为（52.77±1.85）μg/mL，这与上述多酚含量变化结果相印证。磁场处理能够促进种子的生长，同时促进多酚的次级代谢，从而影响多酚的含量、种类、结构，提高其对-葡萄糖苷酶的抑制率，说明磁场处理发芽玉米酚类物质有良好的降糖效果。

图5 发芽玉米酚类物质对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig. 5 Effects of phenols on α-glucosidase activity in germinated maize

2.5.2 发芽玉米酚类物质对-淀粉酶活性的影响

-淀粉酶作用在小肠中是消化碳水化合物的关键酶，由图6可知，游离酚和结合酚对-淀粉酶的抑制作用存在明显差异，随着磁场处理时间的延长，游离酚和结合酚的-淀粉酶IC均呈逐渐下降后上升的变化趋势。在磁场强度3.5 mT下处理60 h，游离酚的-淀粉酶IC为（35.89±1.46）μg/mL，结合酚的-淀粉酶IC为（70.49±1.76）μg/mL，与对照组比存在显著差异（＜0.05）。Worsztynowicz等的研究结果证明了多酚中酚酸类物质是抑制-淀粉酶活力的主要物质，磁场处理玉米发芽提高了其酚酸类物质的含量，进而提高了其降糖活性。

图6 发芽玉米酚类物质对α-淀粉酶活性的影响Fig. 6 Effects of phenols on α-amylase activity germinated maize

3 结 论

本实验结果表明，在磁场强度3.5 mT条件下处理60 h时，玉米籽粒的芽长、发芽率显著提高，与对照组相比，结合酚、游离酚含量分别提高72.72%、47.16%，游离酚中丁香酸和对香豆酸含量显著增加，分别为（206.72±8.26）、（753.20±10.25）μg/g，在此条件下体外降糖实验效果最佳，游离酚对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的IC分别为（18.21±0.52）、（35.89±1.46）μg/mL，结合酚对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的IC分别为（52.77±1.85）、（70.49±1.76）μg/mL，低频静磁场处理后，多酚代谢关键酶PAL、4CL、C4H活力得到提高。综上，低频静磁场能够促进玉米发芽，富集酚类物质，增强酚类物质降糖活性。本研究可为发芽玉米食品的开发提供一定的理论参考。