高强度超声对凡纳滨对虾蛋白结构和功能特性的影响

戴泽川，毛相朝,2，郝亚楠，李 娇,*

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.青岛海洋科学与技术国家试点实验室，海洋药物与生物制品功能实验室，山东 青岛 266237）

凡纳滨对虾（）是世界第一大养殖虾种，产量占世界养殖虾总产量的70%，其味道鲜美，具有很高的营养价值，深受消费者喜爱。我国养殖凡纳滨对虾年产量达170万 t，已成为我国水产养殖的支柱性产业。虽然我国对虾产量大，但是虾类加工产品的总量低、种类少，并且加工产品大多是以鲜活虾和冷冻虾为主的初级加工产品，精深加工产品比例还远落后于发达国家。凡纳滨对虾的常见食用方法是热加工，但是热加工在杀菌钝酶的同时对虾的食用品质会造成较大改变，并且热加工对虾致敏性的消减效果甚微。非热加工是一种新兴的食品加工技术，包括超高压、超声波、高压二氧化碳、电离辐射、高压脉冲电场、等离子体等，符合“最低限度加工”的趋势，能较大程度保留食品的营养和风味，近年来非热加工对食品致敏性的消减也引起了广泛关注。

超声波是指频率高于20 kHz的声波，超声波在各个领域的应用主要是依靠其在介质中传播时产生的空化效应，以及伴随超声波产生的膨胀、闭合、振荡等一系列动力学过程。研究发现低频高强度的超声波（20～100 kHz，强度大于10 W/cm）在蛋白质结构修饰和改变方面中具有广泛的用途；而在水产加工领域，也已经有应用超声波对鱼类肌肉蛋白进行改性的研究，通过超声波提高鱼类肌原纤维蛋白的凝胶强度，应用于鱼糜制品中可以增加产品附加值。目前超声波在凡纳滨对虾类研究中主要应用在杀菌、保鲜和辅助解冻方面，对凡纳滨对虾蛋白的结构和功能特性影响的研究还较少，且鲜见进一步阐明其作用机理的报道。因此，本实验以凡纳滨对虾为研究对象，通过不同时间的高强度超声波处理虾肌肉全蛋白匀浆，观察超声波处理对样品肌肉组织和微观结构的影响；此外，将高强度超声处理样品进一步冻干成虾粉，探究超声对对虾蛋白致敏性、二级结构、平均粒径及其理化和功能特性方面（如总抗氧化能力、游离氨基酸含量和体外蛋白消化率）的影响，为将超声应用于凡纳滨对虾的精深加工提供新的思路和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凡纳滨对虾（平均体长（8.96±0.47）cm、体质量（33.76±1.07）g）购于青岛市市南区团岛市场。

胰蛋白酶（T8150-10G，250 U/mg）、胃蛋白酶（P8160-10G，250 U/mg）、甲苯胺蓝水溶液 北京索莱宝科技有限公司；EPC-TPM-5虾原肌球蛋白酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）2.0试剂盒 美国Indoor Biotechnologies公司；氨基酸缓冲溶液 日本三菱株式会社；WAKO茚三酮显色液缓冲溶液R1、R2 日本和光纯药株式会社。

1.2 仪器与设备

PL2002电子天平、DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司；Elixtm纯水机 美国Millipore公司；pHSJ-4实验室pH计 上海精密科学仪器有限公司；Z36HK高速冷冻离心机 德国Hermle公司；CR21G高速冷冻离心机、L-8900全自动氨基酸分析仪日本Hitachi公司；SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机、SDC-6低温恒温槽 宁波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位仪 英国马尔文仪器公司；Ni-E电动荧光显微镜 日本尼康公司；Nova Nano SEM450扫描电子显微镜 美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将新鲜凡纳滨对虾用清水冲洗干净，放入-20 ℃冰箱12 h致死，并在4 ℃条件下解冻，去头、尾之后取虾肉，按照质量体积比1∶3将虾肉与蒸馏水用匀浆机打匀。超声处理条件：将上述虾肉匀浆转移到50 mL离心管中，以超声功率300 W、超声频率20 kHz和超声强度382 W/cm对对虾肉匀浆分别超声处理0（对照）、5、15、25、35 min，超声探头直径为10 mm，用低温恒温槽循环系统控制超声温度在20 ℃以下，占空比为50%，超声2 s间隔2 s。超声处理后取样，用光学显微镜进行微观结构观察，剩余样品在-80 ℃冰箱预冻后，在真空冷冻干燥机中-50 ℃下干燥48 h，冻干后的样品在-20 ℃冰箱保存，待下一步检测。

1.3.2 微观结构的观察

参考Stratakos等的方法用移液枪将稀释过的10 μL虾样品置于载玻片上，使用质量分数0.1%的甲苯胺蓝水溶液染色3 min，使用配有数码相机的荧光电动显微镜，在20 倍物镜下观察虾样品肌肉组织的微观结构。

参考Wang Jia等的方法，将超声处理后的蛋白样品冷冻干燥48 h之后，取冻干粉末使用扫描电子显微镜观察微观结构，放大倍数设置为250 倍，加速电压为5.00 kV，使用扫描电子显微镜自带软件进行图像采集。

1.3.3 平均粒径的测定

称取虾粉充分溶于双蒸水中，调整虾粉质量浓度至1 mg/mL，使用纳米粒度及Zeta电位仪测定平均粒径，采用protein测定程序，平衡时间3 min，每轮测试10 次，分析虾粉溶液的粒度分布。

1.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）按照Laemmli的方法进行。使用的电泳预制胶质量分数为10%，分别将待测样品溶液（5 mg/mL）与5×蛋白上样缓冲液（体积比1∶4）充分混合，并在95 ℃水煮10 min后制成电泳样品，180 kDa彩虹Marker上样10 μL，电泳样品上样10 μL，先使用80 V电泳20 min，之后调整电压到120 V电泳2 h，待电泳结束后取出预制胶，在55 ℃下使用考马斯亮蓝染色液染色1 h，然后用脱色液（体积分数10%乙酸、体积分数5%乙醇）脱色，直至蛋白质条带清晰。

1.3.5 过敏原检测

按照Dong Xin等的方法，通过双夹心法ELISA试剂盒测定虾中的过敏原原肌球蛋白的含量。

1.3.6 总抗氧化能力测定

参考Nadeem等的研究，采用铁离子还原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法检测虾样品的总抗氧化能力。FRAP工作液是在室温下分别将20 mmol/L氯化铁溶液、300 mmol/L乙酸缓冲液和10 mmol/L 2,4,6-三吡啶--三嗪按体积比1∶1∶10混合而成，现配现用。将FRAP工作液（180 μL）和虾蛋白溶液（5 μL 5 mg/mL）分别加入96 孔板的微孔中，在黑暗中37 ℃孵育5 min后，用酶标仪在593 nm波长处测定吸光度。以1 000 μmol/L硫酸亚铁溶液为标准溶液制备标准曲线，测定抗氧化活性。

1.3.7 二级结构变化

根据刘斌等的方法，使用傅里叶变换红外光谱仪分析样品蛋白的二级结构。将干燥后的虾粉样品与KBr混合均匀，通过压片法压片，以4 cm的分辨率进行32 次扫描，采集样品之前先采集背景，以消除空气对实验结果的影响。样品的傅里叶变换红外谱图采用OMNIC 9.2软件处理对原图谱进行自动修饰校正，使用PeakFit v4.12软件对红外图谱进行基线校正、去卷积、二阶导数处理和高斯拟合，去卷积的参数控制半峰宽为40.0，增强因子1.9；高斯拟合的子峰在8～10之间。根据得到的数据分析相应波数处对应的二级结构相对含量。

1.3.8 巯基含量测定

巯基含量测定的原理是巯基基团与5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)反应会生成黄色化合物，其在412 nm波长处有最大吸收峰。参考张自业和杜琛等的方法并稍作修改进行巯基含量的测定。准确称取0.2 g虾粉溶于10 mL磷酸盐缓冲液中，8 000×、4 ℃离心10 min，取上清液40 μL加入到160 μL缓冲液中（0.01 mol/L乙二胺四乙酸、0.1 mol/L KHPO，pH 6.0），再加入10 µL Ellman试剂（0.01 mol/L 5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)、0.01 mol/L KHPO，pH 6.0），充分混合后室温避光静置25 min，使用酶标仪于412 nm波长处测定吸光度。

1.3.9 游离氨基酸含量的测定

准确称取1 g样品加入至10 mL 0.02 mol/L稀盐酸溶液，充分均质后用冷冻离心机（5 000 r/min、4 ℃）离心10 min，收集上清液。将剩余残渣加入至10 mL 0.02 mol/L稀盐酸中搅拌，再次离心5 min，合并两次离心上清液，定容至50 mL。定容后移取2 mL样品溶液，加入2 mL质量分数5%磺基水杨酸溶液，再次离心（5 000 r/min、4 ℃）10 min，然后经0.22 μm水相过滤膜过滤，通过L-8900全自动氨基酸分析仪进行测定。色谱柱为P/N 855-4507标准蛋白水解分析柱（4.6 mm×60 mm）；流动相为氨基酸缓冲溶液、茚三酮缓冲溶液R1、R2；分离柱温度：梯度升温；梯度洗脱；反应柱温度：135 ℃，进样体积：10 μL。

1.3.10 总可溶性蛋白含量测定

准确称取经过不同处理的冻干虾粉样品0.2 g，溶于10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，7 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液，采用考马斯亮蓝G250检测法测定虾样品的总可溶性蛋白含量，首先用系列质量浓度的牛血清白蛋白绘制标准曲线。吸取40 μL待测样品与200 mL考马斯亮蓝G250充分混合，室温避光反应5 min后，用移液枪吸取200 μL至96 孔板，在595 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线方程计算样品的总可溶性蛋白含量。

1.3.11 体外蛋白模拟消化测定

根据Hejazi和刘艳美等的方法并加以改进，采用胃-胰蛋白酶两步消化法对虾粉进行体外模拟消化。使用1 mol/L HCl溶液将样品（20 mL 50 mg/mL）pH值调至2，将胃蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中，按照样品与胃蛋白酶100∶1的质量比添加胃蛋白酶，37 ℃恒温摇床中消化3 h，用1 mol/L NaOH溶液终止反应，调节pH值至7.6，将胰蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中，按照样品与胰蛋白酶100∶1的质量比加入胰蛋白酶，37 ℃条件下消化2 h，用双缩脲法测定蛋白质量浓度，体外消化率按下式计算。

式中：为消化前的蛋白质量浓度/（mg/mL）；为消化后的蛋白质量浓度/（mg/mL）。

1.4 数据处理与分析

实验重复3 次，结果用平均值±标准差表示，并利用SPSS 26.0统计分析软件中Duncan multiple range test法对数据间进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 超声对对虾肌肉提取物微观结构的影响

Aguilera等指出，结构和功能之间存在联系，要想正确分析和控制食物的属性，对其加工过程中微观结构的了解至关重要。本研究使用荧光电动显微镜和扫描电子显微镜观察不同超声时间处理的虾样品。通过图1可以观察出，未经过超声处理的样品细胞组织之间连接紧密，且分布不均匀，超声5 min的样品与之相比细胞组织之间分布松散、空隙增大；随着超声时间的延长，样品组织之间的间隙进一步增大，在视野范围内分散得也更加均匀，而超声25 min和超声35 min的细胞结构之间没有明显差异，分布都比较均匀松散。

图1 不同超声时间处理虾样品的荧光电动显微镜图Fig. 1 Fluorescence electromotive microscopic images of shrimp samples treated with ultrasound

从图2扫描电子显微镜观察结果可以看出，未经过超声处理的样品显示出完整、光滑的边缘，而超声处理5 min就能明显观察到片状组织碎片的产生；超声时间延长至15 min可以观察到更多的碎片，并且开始出现条状组织碎片；超声25～35 min可以看到表面出现了不规则的孔洞，结构被破坏的程度进一步加剧，可能是超声产生的剪切力和空化作用对虾样品的微观结构造成了破坏，且随着超声时间的延长破坏程度也增大。

图2 超声处理虾样品的扫描电子显微镜图Fig. 2 SEM images of shrimp samples treated with ultrasound

2.2 超声对对虾蛋白粒径的影响

粒径的变化可以反映出蛋白质的聚集程度。由图3可知，与对照组相比，超声处理5 min后，平均粒径从（268.70±3.70）nm下降到（153.90±2.67）nm，说明超声波处理可以显著减小蛋白质的平均粒径，这是超声过程中的空化泡破裂产生的机械力高速剪切，使得蛋白质溶液变得更均匀。超声波处理25 min后，平均粒径降至（112.40±3.00）nm，随着处理时间的继续延长，平均粒径变化不显著，超声35 min时平均粒径甚至略有上升，这可能是过度超声处理使蛋白质发生变性，蛋白质分子之间非共价键被破坏，形成新的化学键，使得相互作用力增加，从而使蛋白质分子产生聚集现象。孙攀研究超声处理对金枪鱼肌原纤维蛋白粒径的影响，也发现在超声18 min时蛋白的平均粒径降低28%，但是延长超声时间至24 min时，粒径反而增加。此外，叶钰等研究发现超声波处理可以使蛋清蛋白部分蛋白质分子平均粒径变小，还可以使整体粒径分布范围变窄，均匀度提高；而蛋白平均粒径的降低，从理论上可以增加蛋白的消化率。

图3 超声对对虾蛋白粒径的影响Fig. 3 Influence of ultrasound on the particle size of shrimp proteins

2.3 超声对对虾原肌球蛋白含量的影响

原肌球蛋白（34～36 kDa）是对虾的主要过敏原，具有一定的热稳定性。Shriver等分别用煮沸和脉冲紫外光处理大西洋白虾，发现用脉冲紫外光处理大西洋白对虾4 min可以使虾原肌球蛋白的反应原性和免疫球蛋白E结合水平降低，而煮沸反而会增加原肌球蛋白和免疫球蛋白E的结合能力。由图4可知，35 kDa处蛋白电泳条带随着超声时间的延长颜色逐渐变浅，说明超声处理后35 kDa处原肌球蛋白含量随处理时间的延长呈下降趋势。由图5可知，经ELISA定量分析，随着超声时间的延长，原肌球蛋白含量从对照组的（2.09±0.08）ng/mg降低至超声处理25 min后的（0.81±0.06）ng/mg（＜0.05），在超声35 min时原肌球蛋白的含量降到最低（（0.78±0.08）ng/mg），降低了62.68%，表明超声波可以显著降低原肌球蛋白含量，进而降低对虾致敏性，这可能是高强度超声产生的空化作用以及引入的自由基攻击原肌球蛋白的结构所致。Liu Guangxian等研究了超声处理对乳糖蛋白致敏性的消减作用，结果表明，经超声处理后乳糖蛋白抗原性出现一定程度降低，且随着超声处理时间的延长乳糖蛋白抗原性不断降低，本研究结果与之相符。

图4 超声处理对虾蛋白的SDS-PAGE图Fig. 4 SDS-PAGE patterns of shrimp proteins subjected to ultrasonic treatment

图5 超声对对虾样品原肌球蛋白含量的影响Fig. 5 Influence of ultrasonic treatment on tropomyosin content in shrimp samples

2.4 超声对对虾肌肉蛋白二级结构的影响

采用傅里叶变换红外光谱分析不同超声时间处理对对虾肌肉蛋白二级结构的影响。对于酰胺I区，不同的波数范围对应不同的二级结构，其中1 600～1 640 cm对应-折叠，1 640～1 650 cm对应无规卷曲，1 650～1 660 cm对应-螺旋，1 660～1 700 cm对应-转角，通过Peakfit 4.12软件拟合可以得到虾蛋白二级结构相对含量。从图6和图7可以看出，随着超声时间的延长，无规卷曲相对含量明显减少，而-转角和-折叠相对含量总体有所增加，表明超声波处理使蛋白质二级结构中部分无规卷曲向-转角和-折叠转化，这与Jiang Lianzhou等研究超声波处理对黑豆蛋白二级结构影响的结果一致。-转角是对虾蛋白二级结构的主要组成部分，经过超声之后其相对含量较对照组略有增加，而-螺旋相对含量的变化随着超声时间的延长而减少，这使得蛋白二级结构趋向于展开，这与Yang Xue等研究300 W超声波处理使大米蛋白二级结构-螺旋向-折叠转化的结果相符。综上，超声处理可以使虾蛋白的二级结构发生变化，从无规卷曲、-螺旋向-折叠和-转角转化。

图6 超声对对虾蛋白傅里叶变换红外光谱的影响Fig. 6 FTIR spectra of shrimp proteins treated by ultrasound

图7 超声对对虾蛋白二级结构的影响Fig. 7 Influence of ultrasonic treatment on secondary structure of shrimp proteins

2.5 超声对对虾肌肉蛋白巯基含量的影响

巯基基团属于弱二级键，可以参与次级键的形成，起到稳定蛋白质三级结构的作用，巯基含量和表面疏水性的变化在一定程度上可以揭示蛋白三级结构的改变。从图8可以看出，虾肉中巯基含量随着超声时间的延长逐渐增加，当超声处理35 min时，巯基含量从对照组的19.52 μmol/g显著提高到25.81 μmol/g。巯基含量的增加可能是超声产生的空化作用破坏了蛋白质分子的结构，使蛋白质的结构趋向于延伸和展开，导致在蛋白质内部的巯基等疏水基团暴露；也可能是超声波在液体介质传播中产生的剪切力和湍流作用导致虾肉蛋白中二硫键断裂，从而产生了新的巯基。

图8 超声处理对对虾样品巯基含量的影响Fig. 8 Influence of ultrasonic treatment on sulfhydryl content of shrimp samples

2.6 超声对对虾样品总抗氧化能力的影响

图9反映了超声波处理对对虾蛋白抗氧化能力的影响。对虾蛋白的总抗氧化能力随着超声处理时间的延长而逐渐增加，超声35 min时，从（24.61±1.14）μmol/100 mg增加到（47.76±1.64）μmol/100 mg，表明长时间的高强度超声处理有利于增加虾样品的抗氧化能力。Abid等的研究结果表明超声处理能显著提高苹果汁的自由基清除能力，超声处理后苹果汁总抗氧化能力显著提高，这是由于超声波的机械作用增加了果汁中抗坏血酸和多酚类化合物的提取率和有效性。因此，推测超声波处理也可能提高了虾肌肉提取物中抗氧化活性物质的提取率，导致对虾样品的总抗氧化能力提高；除此之外，Alicia等发现经过热超声处理的黑莓汁与普通巴氏杀菌黑莓汁相比，抗氧化活性和灭酶能力显著提高。由此推断，在超声波处理的过程中一些与氧化反应相关的酶（如多酚氧化酶）由于超声的空化作用引入自由基攻击而失活，这也可能会增加样品的总抗氧化能力。

图9 超声对对虾样品总抗氧化能力的影响Fig. 9 Influence of ultrasonic treatment on total antioxidant capacity of shrimp samples

2.7 超声对对虾肌肉提取物游离氨基酸含量的影响

凡纳滨对虾具有较好的营养保健价值，虾肉中含有18 种氨基酸，其中必需氨基酸占比达到近40%。通过表1可以看出，随着超声波处理时间的延长，部分游离氨基酸的含量明显增加，这是超声波的空化效应及伴随其产生的机械作用和瞬时高温高压破坏了蛋白质肽链，以及对蛋白质结构的破坏可能使更多酶作用位点暴露所致。其中甘氨酸、天冬氨酸等呈鲜味的氨基酸含量增加较多，脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸等和甘味相关的氨基酸含量也明显提高。同时发现，一些人体必需氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸的含量明显增加，其在人体中可以起到抗氧化和增强免疫力的作用，精氨酸含量的增加对人体代谢具有积极的作用，它能催化鸟氨酸循环的进行、促进尿素的形成，从而使人体内的氨变成无毒尿素，这些必需游离氨基酸含量的增加从理论上可以提高产品的营养价值。

表1 超声对对虾样品游离氨基酸含量的影响Table 1 Effect of ultrasonic treatment on the contents of free amino acids in shrimp samples mg/g

2.8 超声对对虾可溶性蛋白含量及体外消化率的影响

由表2可知，长时间的超声处理降低了对虾样品的总可溶性蛋白含量，经过超声处理35 min后对虾样品的总可溶性蛋白含量从（331.83±7.75）mg/g显著降低到（232.29±9.47）mg/g（＜0.05）。Kang Dacheng等发现20 kHz超声波处理30～120 min后，牛肉的总可溶性蛋白含量会显著降低，这可能与超声波处理后超声空化泡破裂产生的强微射流作用于蛋白质，导致其氢键和肽链断裂有关，同时由于蛋白质结构的破坏，埋藏在内部的疏水性基团更多暴露在表面，这也导致了可溶性蛋白含量的降低。经过超声处理5 min后的虾肌肉提取物体外消化率与对照组相比有所提高，超声15 min时显著提高到78.13%，超声35 min时消化率显著提高到81.97%。根据Dong Xin等的研究，高强度超声处理20 min能显著增加虾样品的体外消化率，超声波处理使蛋白质构象展开和平均粒径降低，可以提高体外蛋白消化率；Jia Junqiang等也发现，在20 kHz、1 500 W、20 min超声处理条件下脱脂小麦胚芽蛋白肽的酶解消化率提高到21.0%，这可能是超声波的微射流和空化作用导致蛋白质结构改变，使蛋白质构象从卷曲和紧密折叠到趋向于展开，增加了和酶反应的活性位点数量和空间，从而进一步增加了消化率。

表2 超声对对虾可溶性蛋白含量和体外消化率的影响Table 2 Effect of ultrasonic treatment on solubility and in vitro digestibility of shrimp proteins

3 结 论

本研究以凡纳滨对虾为研究对象，通过超声波处理凡纳滨对虾肌肉全蛋白提取物，探究高强度超声对凡纳滨对虾蛋白结构和功能的影响。结果表明，高强度的超声波处理可以改变凡纳滨对虾的微观结构，同时显著降低原肌球蛋白含量；经高强度超声处理后凡纳滨对虾蛋白质的二级结构也发生改变，无规卷曲相对含量明显减少，-螺旋相对含量略有降低，-折叠和-转角相对含量增加；高强度超声还可以影响凡纳滨对虾的理化和功能特性，提高其抗氧化能力和游离氨基酸含量；同时蛋白平均粒径也随着超声时间的延长而减小，体外蛋白消化率则会因为超声处理而增加，表明高强度超声处理产生的空化作用、剪切力和湍流力等作用对虾肌肉蛋白产生影响，可以有效降低虾蛋白的致敏性，改变虾蛋白的结构和功能特性以及提高其潜在的营养价值。