昼夜节律与肉羊养分消化代谢和瘤胃发酵参数的关联

张春桃，马涛，屠焰，刁其玉

中国农业科学院饲料研究所/农业农村部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081

0 引言

【研究意义】生物体生命活动随昼夜交替、四时更迭的周期性运动，叫做昼夜节律。动物在白天和夜晚对营养的需求量是不同的，对各种营养物质的消化、吸收和代谢并非同步进行，早上和晚上饲喂同一标准的日粮并不一定科学，这可能会造成营养物质吸收利用和相互转化的不充分而导致额外消耗。由此可见，昼夜节律与动物本身的消化生理及生长性能存在着密切的内在关联。基于此，了解并遵循动物消化代谢的昼夜节律特点不仅可以提高饲料利用率，最大程度地发挥其功效，还可以促进动物健康，提高养殖效益，减少环境污染，具有广泛的应用前景。【前人研究进展】有研究表明，给予断奶仔猪长光照，可促进其日采食量和提高日增重，减少维持能量，提高能量利用率和饲料转化效率。一天饲喂时间和饲喂次数的不同可显著影响奶牛泌乳的日节律、机体代谢及瘤胃发酵功能；生物钟与乳腺代谢功能密切相关，且饲喂高精料可通过下调生物钟基因表达，使泌乳性能下降。夜间限时饲喂奶牛，改变了血液激素、乳汁合成和代谢产物的昼夜节律，通过改变营养物质消化吸收的时间调节牛奶合成的阶段，表明乳腺的分子时钟可以重置。在上午时段绵羊的生理机能强于下午时段，此时体内供氧充足，心、肝功能良好，酶活性较强，消化代谢处于最佳阶段，说明绵羊体内存在固定的生物钟节律。【本研究切入点】我国是世界养羊第一大国，有关生物节律在羊养殖领域的研究报道极为鲜见，在时间轴上对湖羊机体代谢及瘤胃内环境昼夜节律性的研究少见报道，当前肉羊养殖过程中，人们往往忽略动物机体在不同时间内器官组织对营养物质代谢的变化规律，本研究前期结果表明，生长湖羊白天饲喂高精料有助于提高羊只生长性能、降低料重比，且相应减少日粮成本。羊只是否同其他生物一样存在白天与夜间的生物学节律？本研究以湖羊为试验动物，探究昼夜及不同饲喂模式对其生长性能、物质消化代谢和瘤胃发酵参数的影响，进一步揭示其内在关联。【拟解决的关键问题】在一天内采食总量和总体营养相同的情况下，对早晚饲粮营养配比进行调整，将营养物质进行动态配制并对饲喂方法进一步精确化。以便在实际生产中根据反刍动物消化生理特点，充分发挥肉羊本身的主观能动性，提高育肥羊生长性能和营养物质的利用率。为肉羊养殖研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2020年9—11月在中国农业科学院南口中试基地进行，历时70 d。其中预试期10 d，正式期60 d。

1.2 试验动物及试验设计

本试验采用单因素试验设计，选取体况良好、体重（21.57±0.77）kg的湖羊公羔45只，随机分为3处理。各处理组的饲喂日粮相同，精粗比为56∶44，精料和粗料分别饲喂。每天饲喂2次，早上在日出时分饲喂；下午在日落时分饲喂。试验期间，次日晨饲前收集前一日剩料并称重记录。3个处理分别设置为：白天处理组，即早上饲喂日总精料的 70%+日总粗料的30%，记为DH；晚上处理组，即早上饲喂日总精料的30%+日总粗料的70%，记为DL；对照组，即早上和晚上各饲喂日总精料的 50%+日总粗料的 50%，记为CON。详见表1。试验中，根据羊只的日粮进食量，每周按同样的精粗比上调日粮供给量，确保羊只有 5%的剩余饲料，羊只自由饮水。试验所用精料及粗料组成和营养水平见表2。

表1 昼夜节律试验设计Table 1 Experimental design of circadian rhythm

表2 饲粮组成及营养水平（干物质基础）Table 2 Composition and nutrient levels of Diets (DM basis)

于饲养试验第50天开始，每组中抽取体重相近的8只试验羊进行消化代谢试验（预试期5 d，正式期5 d），采用全收粪法每日收集新鲜粪便。试验所用精料及粗料组成和营养水平见表2。试验用精料购于禾丰集团；粗饲料为羊草，购于北京三石奶牛场。

1.3 样品采集

1.3.1 消化代谢样品 饲粮样品：采用四分法收集饲粮样品，65℃烘至恒重，粉碎后装于自封袋中，-20℃保存待测。

粪样：正式期间，每日收集各个试验羊只的鲜粪，参照100 g鲜粪加入10%的稀盐酸10 mL对样品进行固氮，-20℃保存待测。将收集的所有粪样混合均匀后在65℃条件下烘48 h，然后室温回潮 24 h，测定初水分并粉碎。参照实验室常规成分分析方法测定营养物质的表观消化率。

尿样：每天记录每只羊的尿重，用装有 200 mL的10% HSO的塑料桶收集尿液，稀释至5 L，对稀释尿液充分混合，用纱布过滤后每天取样100 mL冷藏保存。

1.3.2 瘤胃液样品 正式试验结束后，分别于晨饲前和晚饲前2 h采用瘤胃导管从口腔采集瘤胃液，4层纱布过滤后立即测定pH，剩余样品转移至15 mL离心管中，置于-20℃冰箱中备用，用于测定瘤胃发酵参数。

1.4 测定指标

1.4.1 养分消化率 干物质含量参照《饲料分析及饲料质量检测技术》中方法测定；粗蛋白含量采用全自动凯氏定氮仪（KDY－9830）测定；有机物含量采用马弗炉灰化法测定（有机物含量=100-粗灰分含量）；粗脂肪含量采用ANKOMXT 15全自动脂肪仪器测定；中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维含量采用VAN SOEST的纤维分析方法。各养分计算公式如下：

1.4.2 瘤胃液相关参数测定 使用便携式 pH计（testo-206-pH2.德国）测定 pH；用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮（NH-N）浓度；采用嘌呤法测定微生物蛋白（MCP）浓度；采用气相色谱法测定挥发性脂肪酸（VFA）浓度。

1.5 数据统计与分析

试验所得数据用Excel进行初步整理，消化代谢数据再用 SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）；瘤胃参数进行双因素方差（two-way ANOVA）分析，并用Duncan氏法进行多重比较，检验差异的显著性。＜0.05为差异显著，＞0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 昼夜节律与肉羊养分表观消化率的关联

昼夜节律与肉羊养分消化率的关联见表3。可以看出在消化代谢试验期间与CON相比，DH组羊的DM、OM、CP、NDF和ADF的表观消化率有升高趋势，其中DM提高了10.10%，CP提高了7.92%；与DL组相比，DH组DM消化率提高了21.42%，CP提高了22.29%，NDF提高了9.85%，ADF提高了 28.69%；DH组羊，干物质采食总量低于其他 2个组。

表3 昼夜节律与肉羊瘤胃营养物质的关联Table 3 Relationship between circadian rhythm and rumen nutrients in mutton sheep

从表4可以看出，DH组羊只尽管氮的摄入量和总排出氮均低于CON组和DL组，然而羊只沉积氮、氮利用率及氮的生物学价值均高于另外两组（＜0.05）；其中沉积氮较CON高了17.28%，较DL提高了58.43%。氮利用率与CON相比提高了21.81%，与DL相比提高了73.74%，氮的生物学价值比CON高了20.31%，比DL高了67.41%。

表4 昼夜节律与肉羊蛋白质代谢的关联Table 4 Relationship between circadian rhythm and rumen protein metabolism in mutton sheep

表5反映了瘤胃pH、NH-N、MCP的昼夜、不同处理对pH有着显著影响（＜0.05），表现为白天高于夜间，且DH组羊只瘤胃pH均低于另外两组（＜0.05）。对于NH-N，DH组羊只最高，夜间则低于对照组，对于MCP，全部试验羊只白天高于夜间，DH组羊只白天阶段MCP浓度高于夜间（＞0.05）。

表5 昼夜节律与肉羊瘤胃pH、NH3-N、MCP的关联Table 5 Relationship between circadian rhythm and rumen pH, NH3-N and MCP in mutton sheep

在肉羊生长育肥期间，发酵时间（白天和晚上）、不同处理对丙酸和乙丙比均有显著影响（＜0.05，表6）。发酵时间对乙酸、丙酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸和乙丙比在白天和夜晚两个时间段有明显差异（＜0.05），白天的数值高于夜间；不同处理组对丙酸、丁酸、戊酸和乙丙比有显著影响（＜0.05）；二者的交互作用显著影响着乙酸、丙酸、戊酸和总挥发性脂肪酸的含量（＜0.05）。白天时间段 DH组的瘤胃液总挥发性脂肪酸、乙酸和丙酸含量显著高于CON组和DL组（＜0.05），而在夜间却低于另外两组（＞0.05），瘤胃液的乙丙比均低于另外两组（＞0.05）。

表6 昼夜节律与肉羊瘤胃VFA的关联Table 6 Relationship between circadian rhythm and rumen VFA in mutton sheep

3 讨论

生命系统拥有极其精确的内部生物钟，调节昼夜节律生物钟的分子机制极其复杂。近年来，科学家们对哺乳动物生物钟的分子机制展开了系列研究，发现在哺乳动物的主要时钟基因由正调控因子 CLOCK、BMAL1、NPAS2和负调控因子PER（Per1、Per2、Per3）、CRY（Cry1、Cry2）、REV-ERBɑ等组成，这些基因构成机体自动调节的正负反馈转录网络，形成了以24 h为周期的节律性振荡。

营养物质消化率的调控是提高动物生长性能的基础，是动物获得足够的能量和物质，进行生长、发育和生产等活动的重要保障。动物营养学中饲料配制和营养物质摄入的精准化研究具有重要而现实的意义。有研究指出，动物机体对营养物质消化代谢表现出典型的季节性、昼夜节律性的周期性变化。

目前，生物钟对机体代谢的调节已经成为畜禽养殖的研究热点之一，对动物的健康及生长性能等均有一定的影响。

以肉羊为例，长期以来，国内外的饲养模式均是以肉羊不同阶段营养需求调配统一的饲粮，即在某阶段,每日早、晚饲喂统一标准日粮，忽视了羊只本身在时间和空间上的生理节律特点。如何将自然状态的昼夜节律生物钟与饲粮的饲喂方式、饲喂时间以及肉羊本身的生理特征联系起来？针对此问题，本试验通过探究昼夜、不同饲养模式下肉羊养分消化代谢、瘤胃内环境的节律性特点，旨在为改善饲料利用率、畜禽生产性能及养殖效益等方面提供一些参考。

3.1 昼夜节律与肉羊营养物质消化率的关联分析

本试验与前期动物饲养试验的研究结果均发现：各组之间羊的干物质采食量基本接近，但随着一天中早上精料比例的升高而采食量出现降低的趋势，这可能是因为与代谢相关的激素具有昼夜节律性，包括食欲抑制剂瘦素，其向下丘脑中的食欲回路发出餐后饱腹感信号，以减少食物的摄入；也可能是引起CLOCK基因下调，导致生物钟发生重置，减弱摄食行为的昼夜节律，增加体质量。这种饲喂模式能够与机体代谢规律相协调，最大限度地增加营养素的利用率，并相应减少日粮营养成分的浪费。在单胃动物方面，GAO 等通过探究每日饲喂 2种不同钙水平日粮对妊娠母猪胎盘糖脂代谢和运输的影响，发现高钙-低钙组（H-L）和低钙-高钙组（L-H）抑制胎盘中 PER2的mRNA表达，通过调控脂质代谢相关mRNA表达和昼夜节律生物钟，进而影响猪胎盘糖代谢和转运。WU等研究得出类似结果：相同光照条件下，早上饲喂高蛋白日粮，晚上饲喂低蛋白日粮可显著提高育肥猪的生长性能。关于反刍动物，张崇志等发现饲料成本不变的情况下，蛋白水平日动态日粮（早上饲喂高蛋白日粮、晚上饲喂低蛋白日粮）饲喂泌乳期鄂尔多斯细毛羊，可有效增加母羊和羔羊的体重和日增重。上述论断不同的是湖羊是世界上有历史记录的、唯一具有夜食草习性的绵羊，而猪主要在白天活动力度强；因此不同动物机体内在的生物钟分子机制是怎样的还需要后续进一步的研究。

ROMON等研究表明，在夜间湖羊消化器官的机能下降，基础代谢相对较低，若晚上采食过多，易造成营养过剩，导致养分利用不充分。DM和OM的消化率是动物对饲粮消化的综合反映，本研究中，各处理组羊只的营养物质消化吸收在统计学上差异不显著，这可能与消化代谢试验于11月20日进行，此时白昼时间为9 h 54 min，夜长为14 h 46 min，夜间时长较长，夜间机体各器官组织处于休眠的“低运转”状态有关。然而可以看到处理之间存在差异性，DH组 DM、OM的消化率均高于 CON组和DL组，即相同的基础日粮，相同的光照环境，因饲喂时间不同，早上饲喂的精料多，羊只的营养物质消化率就有增加的趋势，这与它们的体增重较大是相吻合的。

与单胃动物不同，反刍动物凭借其特殊的消化生理结构能够消化高纤维饲料，降解多种饲料成分和代谢物。瘤胃是迄今已知反刍动物独有的、降解纤维能力最强的天然发酵罐，其降解产物是动物机体主要的能量来源。本研究在消化代谢期间，NDF和 ADF的消化率为DH组＞CON组＞DL组。这可能与湖羊的基本属性有关，湖羊特点是在夜间安静、干扰少时，食草量大，约占日食草量的2/3，因采食粗料时间跨度较大，再加上夜间安静的环境，湖羊用于反刍的时间较白天久，粗料和颗粒料在瘤胃里滞留的时间较长，更能激发瘤胃的发酵能力，促进营养物质的消化吸收。但也有研究表明动物摄入过量的NDF，可加快瘤胃流通速率，从而导致其不能充分被瘤胃菌群降解利用。因此合理分配早晚精粗料占比，可以促进瘤胃发育，最大程度地加强对营养物质的消化利用，还可以促进动物健康。

脂肪（如三酰甘油）是体内主要的储能物质，脂质代谢也呈现出明显的昼夜节律以满足机体对能量的需要，促进脂质吸收、储存和运输的昼夜节律与休息活动及摄食周期在时间上是协调一致的，本试验中，日粮粗脂肪含量较低，不会出现大的差异。研究发现，只在12 h光照期喂食高脂肪食物的夜间活动小鼠比只在12 h黑暗期喂食高脂肪食物的小鼠营养物质消化吸收利用率高，体重明显增加。这可能与小鼠的生物规律夜间活动有关。

3.2 昼夜节律与肉羊氮代谢的关联分析

反刍动物机体摄入的氮一部分用于合成机体蛋白，另一部分则随代谢产物排出体外，二者构成一个动态平衡体系，且均表现出周期性的波动，这种波动在动物消化代谢生理中体现为其消化道和胃液中主要分解酶类在夜间分泌量较大，但活性较低，导致消化器官夜间的基础代谢率较低，只有在早晨进食后消化酶活性才被充分调动，此时胃排空速率以及肠道的吸收速率较夜间加快，即在早晨时动物机体代谢力度加强。本试验结果与上述论断相符，可以看出：DH组试验羊只氮的摄入量和总排出氮含量趋势一致，均低于另外两组。

氮沉积是动物机体对饲粮蛋白质利用程度的直接指标，本研究中DH组羊只的沉积氮、氮利用率和氮的生物学价值均高于另外两组。可能是早上饲喂的高精料比例的日粮，瘤胃酸度降低，可减少微生物氮在瘤胃中的循环，加速胃排空，提高总氮在十二指肠的流通量，促进含氮类物质的吸收和利用，降低营养物质随粪尿排出，促进了氮的吸收和沉积。也可能是湖羊夜间采食大量的草料，经瘤胃微生物作用进入小肠的蛋白增多，氮沉积率随之增高。

有报道表明：通过采用节律性日粮模式，即每日早上与晚上饲喂不同营养浓度的日粮，机体营养供需达到平衡，粪尿氮排放量降低12%，沉积氮增加，且饲料成本降低1.0%，胴体质量显著提高，本试验结果与此一致。本试验的不足之处是没有在时间轴上去探究白天和晚上时间段的消化代谢规律，仅对比了全天24h不同处理间的差异，同时本试验仅针对瘤胃开展了一系列探究，缺乏对肠道消化代谢等整体系统性的探究，因此后续还需继续探究动物机体各个器官组织对营养物质吸收代谢的昼夜节律特性特点，为人工调控肉羊生长提供可靠的理论依据。

3.3 昼夜节律与肉羊瘤胃发酵参数的关联分析

瘤胃内环境主要指的是酸度（pH）、氨态氮（NH-N）、挥发性脂肪酸（VFA）等。当环境条件（进食时间、温度、饲粮形态与组成等）恒定时，瘤胃菌群的组成、功能及瘤胃内环境的变化便呈现出特定的规律性。稳定的瘤胃内环境是反刍动物获得最佳生长性能的必要前提。pH是反映瘤胃健康状态的重要指标，主要影响因素是日粮的粗饲料水平，正常变化范围在 6.0—7.5之间。本研究中，瘤胃pH在 6.12—7.02之间。具体表现为：DH组试验羊瘤胃pH不论是白天还是夜间，均显著小于另外两组；且3组羊只白天瘤胃pH均显著高于夜间，这是因为 3组试验羊每日饲喂相同含量营养素，早上饲喂较高的精料水平，摄入的NDF含量较低，可以降低反刍动物咀嚼时间，加快饲料降解速率，随着饲粮在胃部的流动，可提高挥发性脂肪酸及丙酸浓度，降低瘤胃pH，而DL组正好相反，早上饲喂粗料比例高，瘤胃pH处于较高水平，当提高晚上的精料比例，DL组羊只 pH则显著降低。该结果与DASILVA等的研究结果相反，其研究表明，瘤胃pH不受日粮CP水平的影响，但该试验仅对比了不同CP对瘤胃pH的影响，然而，本研究中瘤胃液pH产生差异的原因可能是因为早晚饲喂日粮粗蛋白的梯度不同所引起的。

瘤胃 NH-N是瘤胃氮代谢过程中外源蛋白质和内源含氮物质降解的重要产物，饲粮中的蛋白质在瘤胃微生物的作用下产生NH-N，同时NH-N又作为瘤胃微生物合成微生物蛋白的底物，适宜的NH-N浓度有利于微生物蛋白（MCP）的合成。合成微生物蛋白的有效NH-N浓度范围为5.0—30.0 mg·dL。本试验各试验组瘤胃NH-N浓度均在正常浓度范围内。这说明保证全天营养素一致下，改变早晚精料比例不会影响瘤胃微生物正常生长，可满足机体对微生物蛋白需要量。

瘤胃中VFA主要来自饲粮碳水化合物的发酵，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是反刍动物的主要能量来源。可以为动物机体提供约占代谢能75%的能量，乙酸和丙酸通过不同的代谢途径为瘤胃微生物提供营养物质和能量，乙丙比可影响瘤胃微生物的结构，改变瘤胃发酵模式，影响能量的利用。丙酸是反刍动物肝脏糖异生的主要前体物，丙酸比例的增加意味着能量利用效率的提高。

在肉羊生长育肥期间，白天时间段DH组的瘤胃液 TVFA、乙酸和丙酸含量高于夜间，且白天时段显著高于CON组和DL组，在夜间低于另外两组；然而DH组乙丙比全天时段均低于另外两组，因为DH组羊只白天饲喂精料比例高，故丙酸含量高，虽然在该饲喂模式下DH组白天乙酸含量有所增高，但总体增加比例低于丙酸，在夜间饲喂较高比例粗料下，乙酸含量增幅高于丙酸，且对 VFA的吸收有促进作用。KHAFIPOUR等发现饲料精料比例高能显著上调生物钟BMAL1、PER1、CLOCK和tRNA基因的表达，改变瘤胃酸度，影响对 VFA的吸收。徐巧云等研究表明，PER2与VFA吸收存在一定的相关性，调控着VFA的吸收。不同处理对TVFA在统计学上无显著差异，然而不同时间段，即试验羊白天和夜间的TVFA浓度差异显著。KIRAN等研究发现，对育肥羊饲喂两种水平CP日粮，高CP日粮瘤胃液中乙酸和丙酸的浓度均低于低CP组，而对乙丙比影响不大。本试验结果与之不同，白天饲喂高精料，乙酸和丙酸含量显著高于低精料组的羊，而乙丙比则显著降低；与此同时，晚上饲喂高精料，乙酸和丙酸含量高于晚上低精料组的羊，乙丙比则变化不大，但各组全天的乙酸浓度基本相等，这可能是通过调整白天和夜晚营养素含量的分配，引起PER2基因沉默，一些正调节基因功能也随之下调，延长瘤胃对饲料的降解及吸收。

结合课题前期的动物试验结果证实，依据动物自身的生理规律，采用动态饲喂模式，可有效提高饲料养分消化率。通过改变早晚日粮模式，打破动物机体原有的生物钟并进行重置，可提高营养物质利用率和降低饲料成本。在时间轴上对育肥羊瘤胃菌群及内环境的节律特点及分子机制鲜有报道，本试验初次将动物生理营养与生物钟结合起来，从营养物质消化代谢、瘤胃内环境等方面进行综合评价，明确不同营养配制及饲喂方式对湖羊表现性状的影响，为更好地调控肉羊生长提供理论依据。

4 结论

在统一环境与日粮条件下：

（1）各组之间羊的干物质采食量基本接近，早上饲喂高比例精料日粮、下午饲喂低比例精料日粮，可提高试验湖羊干物质、有机物、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维的表观消化率，有利于氮的沉积，更符合机体消化吸收节律；合理选择精料饲喂时间，有利于营养物质的吸收利用。

（2）白昼与夜间对瘤胃发酵有影响。瘤胃中乙酸、丙酸、总挥发性脂肪酸和乙丙比在白天和夜晚两个时间段有明显差异，白天饲喂高比例精料日粮对瘤胃总挥发性脂肪酸、氨态氮和瘤胃微生物蛋白含量增加，对营养物质的吸收具有促进作用。