酸性土壤硝化作用对柑橘铵毒害的效应

范子晗，罗雅尹，熊华烨，张育文，康福蓉，王昱桁，王洁，石孝均，张跃强

西南大学资源环境学院，重庆 400715

0 引言

【研究意义】作为全球最重要的经济作物之一，2019年我国19个省份的柑橘栽培面积和产量分别达到262万公顷和4 585万吨，均居世界首位。我国柑橘主产区位于降雨丰沛的热带和亚热带地区，土壤酸化和养分不平衡，且pH低和缺氧条件下的土壤铵化率高于硝化率，土壤富含 NH。柑橘园中存在的氮肥不合理施用导致一系列的环境和生态问题，严重限制了我国柑橘产业的可持续发展。因此，研究柑橘对酸、碱性土壤中铵态氮水平的响应以及柑橘铵毒害产生机制，对指导柑橘生产中氮肥的合理施用具有重要意义。【前人研究进展】土壤中氮的矿化和硝化作用是氮循环中的重要过程。在酸性土壤中，土壤硝化速率被证明相对较低，且硝化速率随着土壤pH的降低而降低。作为柑橘生长必需的营养元素，NH-N和NO-N是可被柑橘直接吸收利用的氮源。我国柑橘年均氮肥用量为494 kg·hm，其中无机氮施用量占总量的91.4%。三峡重庆库区柑橘园生产体系中氮素主要来源于三元复合肥、尿素和碳铵，土壤酸化和传统施肥方式导致果园生产体系氮养分高盈余量和高铵硝比，造成果园土壤环境氮素高负荷。大量施用含铵肥料导致我国主要农田酸化严重，抑制硝化速率，影响柑橘植株的生长以及氮素吸收。植物的铵毒害症状包括生物量降低、根系构型改变、根冠比下降、叶片失绿等。不同种属或同一种属不同品种之间也存在不同的铵耐受性，通过对前人关于植物不同氮素形态的喜好相关研究发现，可可树、水稻、蓝莓、茶树喜铵态氮；而油菜、棉花、烤烟以及一些藻类对铵态氮敏感，易出现毒害现象。此外，越来越多的证据表明，铵中毒是由氧化还原稳态受损引起的，这增加了活性氧（ROS）的产生，细胞内的抗氧化酶（过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、抗坏血酸过氧化物酶 APX）在此时被激发来降低活性氧的累积。植物吸收 NH后，主要的代谢途径有谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）、谷氨酸脱氢酶（GDH）和天冬酰胺合成酶（AS）。铵转化为氨基酸和酰胺的总速率低于通过氨基酸分解代谢、硝酸盐还原、苯丙代谢和光呼吸吸收和细胞生产铵的速率时，会造成植物组织铵毒性积累。硝酸还原酶（NR）、天门冬酰胺酶（AS）、谷氨酰胺合成酶(GS)作为催化和调节氮代谢的关键酶，每一种酶都可以看作是植物氮素吸收和利用能力的指标。【本研究切入点】目前，我国关于柑橘不同形态氮素施用的系统研究较少，且主要集中在柑橘的氮素喜好、铵硝配比及吸收动力学方面，针对柑橘铵毒害系统研究鲜见报道，有待研究。【拟解决的关键问题】选择我国具有代表性的砧木——香橙，以铵态氮为研究对象，通过盆栽试验探究酸性土壤中柑橘铵毒害的产生原因、特征及响应机制，为柑橘氮素科学管理提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点与试验材料

试验开展于西南大学国家紫色土肥力与肥效监测基地。供试酸性土壤为黄壤，pH 4.13，有机质含量 4.98 g·kg，碱解氮 83.1 mg·kg，有效磷 4.20 mg·kg，速效钾 73.0 mg·kg。供试石灰性土壤为紫色土，pH 8.50，有机质 21.2 g·kg，碱解氮 52.0 mg·kg，速效磷 13.3 mg·kg，速效钾为 156 mg·kg。土壤速效磷测定时酸性土壤采用Bray法，碱性土壤采用 Olsen法。土壤经自然风干，去除杂质后磨细过筛备用。供试柑橘砧木幼苗为香橙（Tanaka）。

1.2 试验设计

试验为双因素试验设计，主处理为2种土壤，分别为黄壤和紫色土。副处理为5个铵态氮水平，分别为 0、50、100、200、400 mg·kg，分别用 A0、A50、A100、A200和A400表示。每个处理10次重复。

1.3 试验方法

2019年10月种子经催芽萌发后移栽入苗圃，2020年1月待种子长到5叶龄时，移入盆中。盆高21 cm，直径21 cm，每盆装土6 kg，磷钾肥作为基肥装盆时与土混匀装入。过磷酸钙供磷，施磷量100 mg·kg，硫酸钾供钾，施钾量150 mg·kg。一盆种植两株柑橘砧木幼苗。利用分析纯硫酸铵试剂在2020年11月以营养液形式按照处理要求一次施入，其余按照柑橘种植常规管理进行，土壤含水量保持为田间持水量的70%。处理前一周布置土壤溶液采集器（Rhizon 19.21.01 SMS），如图1。

图1 土壤溶液采集装置示意图Fig. 1 Schematic diagram of soil solution collection device

1.4 样品采集与项目测定

1.4.1 样品采集 通过土壤溶液采集器隔天采集土壤溶液，并将采集液置于-20℃冰箱保存。于试验第15天和第30天各取5盆采集柑橘幼苗的地上部和地下部，把采集的柑橘根茎叶分开，用去离子水洗净后晾干。取一部分根、茎、叶称鲜重后，在105℃杀青2 h后在75℃烘干并记下干重，烘干后粉碎用于元素分析；另一部分根和叶用液氮速冻后保存在-80℃冰箱用于生理指标的测定。

1.4.2 土壤溶液 使用流动分析仪（AA3）测定土壤铵态氮和硝态氮的质量浓度；土壤溶液 pH用电位计法测定。

1.4.3 植株丙二醛含量 用10%三氯乙酸研磨至匀浆后离心，取上清液与0.5%硫代巴比妥酸反应后于450、532和 600 nm下比色。

1.4.4 植株氮含量的测定 用HSO-HO消煮，并用半微量凯氏定氮法测定氮含量。

1.4.5 抗氧化系统酶活性 氮同化酶活性以及植株铵态氮硝态氮含量采用试剂盒法，试剂盒由苏州科铭生物技术有限公司提供。

1.4.6 参数计算 本文中涉及的相关指标计算公式如下：

1.5 统计分析

使用 SPSS统计软件进行双因素和单因素的方差分析（ANOVA）。均数分析采用最小差异检验（LSD）进行比较（＜0.05），使用Excel进行图表的制作。

2 结果

2.1 土壤类型与铵态氮供应水平对土壤溶液铵态氮硝态氮浓度的影响

如图2所示，两种土壤的土壤溶液铵态氮浓度均随硫酸铵施用量的增加而上升。与酸性土壤相比，石灰性土壤的铵态氮浓度下降较快。如图3所示，两种土壤的土壤溶液的铵硝比均呈先下降后稳定的趋势，石灰性土壤溶液铵硝比在施用硫酸铵后15 d左右已经趋近于0，而酸性土壤土壤溶液在24 d依然保持4.52的铵硝比，并呈稳定趋势。

图2 铵态氮供应水平对土壤溶液铵态氮，硝态氮含量的影响Fig. 2 Effects of NH4+-N levels on concentrations of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in soil solution

图3 铵态氮供应水平对土壤溶液铵硝比的影响Fig. 3 Effects of NH4+-N level on NH4+/NO3- of soil solution

如图4所示，两种土壤在施用硫酸铵后pH均下降，到了第24天时，与A0相比，A50、A100、A200、A400处理酸性土壤的pH分别降低了0.077，0.290，0.190和0.113个单位；石灰性土壤的pH降低了0.170，0.713 ，0.743 和0.777个单位。

图4 铵态氮供应水平对土壤溶液pH的影响Fig. 4 Effect of NH4+-N level on pH of soil solution

2.2 两种土壤中铵态氮供应水平对柑橘生长的影响

由表1可知，叶片和地上部的生物量呈先上升后下降趋势，在A100处理时达到最大值，与A0处理相比分别上升了 20.2%和 16.6%。不同铵态氮施用量下的茎、根、总生物量及根冠比无显著差异。如表2所示，铵态氮水平下酸性土壤中生长的幼苗根长显著大于石灰性土壤，而根表面积、根体积和根平均直径无显著差异。酸性土壤上生长的柑橘幼苗根系的根长、根表面积和根体积随施铵量上升呈先上升后下降趋势。A50处理的根长最高，较A0处理上升了34.6%，而A400处理时最低，较A0处理降低了13.0%。不同铵态氮水平下柑橘的根表面积、根体积和根平均直径无显著差异。由图5可见，两种土壤柑橘根系活力与铵态氮水平呈显著负相关性，酸性土壤=0.82，石灰性土壤=0.28。

表1 铵态氮供应水平对柑橘生物量的影响Table 1 Effects of NH4+-N levels on citrus biomass

表2 两种土壤中铵态氮供应水平对柑橘幼苗根系形态的影响Table 2 Effects of NH4+-N levels on root morphology of citrus seedlings in two soils

图5 两种土壤中铵态氮供应水平对柑橘幼苗根系活力的影响Fig. 5 Effects of NH4+-N levels on root activity of citrus seedlings in two soils

2.3 两种土壤中铵供应水平对柑橘抗氧化系统的影响

由表3可见，两种土壤中生长的柑橘叶片的CAT和SOD活性有显著差异，APX和POD无明显差异。根系的CAT、SOD和POD活性有显著差异，且酸性土壤中生长的柑橘根系CAT、SOD活性小于石灰性土壤，POD活性大于石灰性土壤。不同供应水平下，柑橘叶片的CAT和APX活性无明显差异；而SOD和POD随铵态氮施用量的提高呈先上升后下降趋势，分别在A50和A100处理达到最大值，与A0处理相比分别提高了4.53%和469%。CAT、APX、SOD和POD在15和30 d取样时的活性均有显著差异，除POD以外，其他酶的活性均为30 d低于15 d。各施铵处理的根系CAT、APX、SOD和POD酶活性均大于A0处理。SOD和POD活性随着施铵量的上升呈先上升后下降趋势，分别在A100和A200处理达到最大值，分别比A0处理上升了44.7%和66.9%。CAT、APX、SOD和POD在15和30 d取样时的活性均有显著差异。CAT和SOD的活性30 d取样的低于15 d取样的，APX和POD的活性30 d取样的大于15 d取样的。

表3 铵态氮供应水平对不同土壤中柑橘抗氧化酶活性的影响Table 3 Effects of NH4+-N levels on antioxidant enzyme activities in citrus leaves grown in different soils

2.4 两种土壤中铵态氮供应水平对柑橘氮代谢的影响

如表4所示，两种土壤中生长的柑橘叶片和根系的各氮代谢酶活性均有显著差异。酸性土壤中生长的柑橘叶片 GS、NR和GDH活性低于石灰性土壤，而AS和GOGAT活性高于石灰性土壤；而酸性土壤中生长的柑橘根系GS、GOGAT、AS和NR活性高于石灰性土壤，而GDH活性低于石灰性土壤。随着铵态氮水平的上升，叶片GS、GOGAT、GDH的活性均在 A100处理时达到最大值，先上升后下降趋势，但是叶片NR的活性随着铵态氮上升而下降。根系的GS和GOGAT活性随着铵态氮的升高呈先上升后下降趋势，分别在A200和A100处理达到最大值；GDH和NR活性随铵态氮的升高而降低，AS活性随铵态氮水平的升高而升高。从取样时间来看，不同取样时间对酶活性有显著影响，根系除 GDH活性15 d取样的低于30 d的外，GS、AS、NR和GOGAT活性均为15 d取样的高于30 d。叶片除NR的活性15 d取样的小于30 d以外，30 d取样的GS、GOGAT、GDH活性均为15 d取样的高于30d。

表4 铵态氮供应水平对不同土壤中柑橘叶片氮代谢酶活性的影响Table 4 Effects of ammonium levels on nitrogen metabolism enzyme activities in citrus leaves on different soil

如表5所示，酸性土壤中叶片和根系硝态氮显著低于石灰性土壤，而铵态氮没有显著差异。根系叶片的铵态氮含量随铵态氮水平的提高呈先上升后下降趋势，而硝态氮含量无显著差异。如表6所示，酸性土壤中生长的柑橘叶氮含量均低于石灰性土壤，而茎和根无显著差异；除酸性土壤上生长的柑橘茎、叶和总的氮累积量均低于石灰性土壤，根系没有显著差异。随着施铵量的升高，柑橘茎、叶和根的氮含量呈先上升后下降趋势，且在 A200处理时达到最大值。柑橘的茎、叶、根和总的累积量随铵态氮水平呈先上升后下降趋势，根、茎和叶在A200处理达到最大值，总累积量在A100处理时达到最大值。

表5 铵态氮供应水平对不同土壤中柑橘叶片和根中无机氮含量的影响Table 5 Effects of NH4+-N levels on inorganic nitrogen content in citrus leaves in different soils

表6 铵态氮供应水平对不同土壤中柑橘叶片氮含量和累积量的影响Table 6 Effects of NH4+-N levels on nitrogen concentration and accumulation in citrus leaves in different soils

通过柑橘各部位的生物量、氮累积量、氮浓度、叶绿素含量和根系形态指标进行聚类分析（图6）。柑橘形态指标的聚类结果显示，当平均距离为10时，可以将酸性土壤中的铵态氮水平处理分成两类。当碱性土壤中的铵态氮水平平均距离为20时，不施氮处理和施氮处理各分成两类。

图6 铵态氮供应水平对香橙生长相关指标聚类分析Fig. 6 Cluster analysis of NH4+-N level on growth related indexes of Xiangcheng seedling

3 讨论

3.1 酸性土壤和石灰性土壤铵态氮的转化过程

土壤硝化作用对土壤pH高度敏感，土壤最大硝化速率与土壤 pH呈显著正相关。研究显示，pH每降低一个单位，土壤的硝化速率就会减少42%。在本研究中，酸性土壤的土壤溶液中铵态氮更高，铵硝比保持较高状态（图2，图3），这与鲍俊丹等在培养试验中的结果一致。一般认为土壤 pH与硝化作用的这种关系可能是由于低pH抑制硝化微生物的生长，故不利于硝化作用的进行，而在碱性土壤条件下氨氧化菌丰度较大，适宜硝化作用的进行。同时，施用硫酸铵后酸性土壤和石灰性土壤的pH均有下降，与前人对茶园土壤的研究一致。

3.2 两种土壤铵态氮供应水平对柑橘生长发育的影响

氮素具有促进柑橘生长，增加生物量的作用，有研究认为树种对氮素形态的偏好与土壤pH相关，推测柑橘具有喜铵性。但在对产区大多分布在酸性土壤的柑橘研究中发现，与硝态氮相比，铵态氮对柑橘的根、茎、叶以及总生物量均产生了显著抑制，表现出明显的喜硝性。在本试验中，30 d的试验对柑橘生物量无显著差异（表1），这说明短期高铵对柑橘生物量影响不大。但高铵对柑橘根系伸长和根系活力产生了抑制作用（表2，图2），这可能是由于根系作为生长于土壤中吸收、运输 NH的主要器官，是高NH胁迫下最直接的响应和被毒害器官，与前人的研究结果表现一致。高铵增加了MDA含量，并激发了根系的氧化应激反应（表3），说明高铵加剧了膜脂过氧化程度。且植物的抗氧化系统酶可以有效地清除活性氧，保护其免受破坏性的氧化反应，与前人的研究结果一致。由于 NH特性和酶活性的复杂性，导致酶活性的变化规律不一致：高铵增加了叶片POD酶活性，而其他抗氧化酶活性变化不大（表3），推测POD是此时起主要作用的抗氧化酶。

3.3 柑橘氮代谢对两种土壤铵态氮供应水平的响应

植物对氮素的吸收和累积表现了同化和利用氮的能力。本研究中，酸性土壤柑橘根系中GS、GDH、AS和NR的活性较高。酸性土壤柑橘叶片中GOGAT和GDH活性较高，GS和AS的活性较低。并且高铵降低了根系GOGAT和GDH的活性而增加了AS和GS的活性，高铵增加了叶片AS的活性，降低了NR的活性（表4），与前人的研究结果一致。这是由于在植物体内经一系列的生化过程，NH离子不断产生，这些离子在植物细胞中的积累导致组织损伤，造成铵毒性症状的出现，与前人的研究结果一致。这些因素共同作用促进植物的氮代谢，是植物的基本生理过程。本研究酸性土壤中，柑橘植株的铵态氮含量显著大于石灰性土壤（表5），且柑橘幼苗的根茎叶的总氮累积量较低（表6），这可能由于石灰性土壤经过硝化作用产生的大量硝态氮会对毒害作用进行缓解。

综上所述，土壤中的氮素转化与土壤的pH密切相关，酸性土壤上施铵量超过100 mg·kg时柑橘幼苗的生长受到抑制，而在石灰性土壤上过量使用铵态氮并未显著抑制柑橘生物量，意味着铵毒害的强度与土壤的硝化作用强度密切相关。

4 结论

与石灰性土壤相比，酸性土壤铵态氮施用过量导致土壤溶液中铵离子长时间累积，对柑橘造成毒害。铵毒害现象首先发生在根系，表现为抑制柑橘根系伸长且降低根系活力，同时造成叶片和根系MDA含量增加，细胞膜受损和氮代谢失调等铵毒害现象，说明柑橘铵毒害与土壤硝化作用密切相关,酸性土壤中尤为值得关注。