组织透明化三维成像技术在卵巢组织中的应用进展

陈影，黄金智，吴科锋，李茜

卵巢是哺乳动物生殖系统的重要器官，是女性生殖和健康不可或缺的一部分。对卵巢生理学和病理学的理解依赖于对卵巢形态和结构的阐明，而这种阐明依赖于常规光学显微镜和薄切片。传统的组织切片非常薄，只能反映组织的“冰山一角”，且会损伤组织表面切缘，破坏组织结构的连续性。因此要全面理解复杂的卵巢组织结构，需要在三维的背景下对卵巢组织进行分析。然而，这是一项艰巨的任务，因为卵巢组织标本是不透明的，这阻碍了卵巢组织三维成像的发展。现今，组织透明化三维成像技术提供了一种前瞻性的解决方案，并已成为生物体三维成像和量化的有力工具[1]。该技术可以扩展临床医生对卵巢生理和病理过程的了解，最大限度地降低光散射和光吸收使卵巢组织透明，并可结合荧光标记提高成像深度和图像对比度，更好地研究卵巢组织的特异信息[2]。现综述组织透明化三维成像技术在动物和人卵巢组织生理及病理方面的最新进展，探讨该技术在卵巢肿瘤病理应用中的挑战及潜在价值，以期为卵巢肿瘤病理诊断提供新思路。

1 组织透明化三维成像技术简介

组织透明化三维成像技术是组织透明化技术和光学成像技术的结合。组织透明化技术可分为主动型和被动型，主动型包括CLARITY、PACT 等，被动型分为亲水溶剂型和有机溶剂型。亲水溶剂型又分为简单浸泡型和水化作用型，包括SeeDB、Scale、CUBIC 和ScaleS 等；有机溶剂型包括BABB、DBE、3DISCO、iDISCO 和uDISCO 等。尽管组织透明化技术的种类繁多，但其基本原理和步骤相似，主要区别在于根据不同实验目的调整各步骤中所使用的试剂、仪器和实验时间。主要步骤包括固定、脱脂脱色（脱钙）、透明和折射率匹配。如今组织透明化技术基于成熟，可应用于小鼠全身器官如脑、前列腺[3-5]等，也可应用在实体肿瘤[6]。

然而，仅有组织透明化技术无法完成三维光学成像，还需要光学成像技术的支持。光学成像技术有赖于共聚焦显微镜、双光子显微镜和光片显微镜等的快速发展[7-8]。其中双光子显微镜最适合用于非透明组织的深部成像，对于透明组织，一般选用共聚焦显微镜和光片显微镜。光片显微镜具有信噪比高、拍摄速度快、工作距离长、可观测样品体积大及荧光淬灭速度慢等优点，满足了生物学研究的要求，可用于全器官成像。共聚焦显微镜则具有分辨率高、信噪比高的优点，可观察到亚细胞单位水平。

目前，有研究应用组织透明化三维成像技术结合组织自发荧光、体内荧光标记或离体免疫标记使未切片的组织样本的形态和功能特征的三维可视化成为可能。这种创新的组织透明化三维成像技术提供了对生物学详细而全面的见解，并开辟了组织分析的新维度。其能够研究正常和病理组织特征和疾病进展，并允许在亚细胞单位水平上精确监测完整生物组织中潜在的治疗靶点[9]。许多组织透明化技术已应用于小鼠模型、患者上皮组织和实体肿瘤样本的三维成像[10]，例如人类胰腺癌[11]和前列腺癌[4]。诸多研究都在证明组织透明化三维成像技术可减少冷冻或石蜡包埋切片及病理医生的主观误差，探究传统组织学无法检出的生物样本的空间关系和构造特征，显著提高了组织生理病理诊断的精确性。

2 组织透明化三维成像技术在卵巢组织中的应用

卵巢组织的本质是复杂不透明的三维结构，由生发上皮覆盖，卵巢皮质和髓质构成卵巢实质。虽说是软组织，但其上皮、结缔组织、脉管系统和神经网络均具有不同的折射率，需要借助组织透明化三维成像技术来达到卵巢组织的三维可视化。截至目前，卵巢组织在组织透明化三维成像层面已得到很好的研究，相关组织透明化方法、研究内容和显微镜类型见表1。

表1 组织透明化三维成像技术在动物或人卵巢中的研究

2.1 鼠类卵巢

2.1.1 鼠类卵巢卵泡发育及计数 在组织透明化三维成像技术中，首个利用该技术进行研究的内容是鼠卵泡的发育和计数。而Faire 等[14]也成为该技术在卵巢组织研究的首个团队，他们利用有机溶剂型BABB 组织透明化方法和共聚焦显微镜在三维成像中成功辨别卵泡的生长状态并提供更高通量的卵泡计数方法，这为后续团队的研究提供了信心和思路。但有机溶剂型技术不足以清除更厚的卵巢组织，并且会增加卵巢组织荧光信号的淬灭，不利于长时间观察卵泡的生长状态。Feng 等[23]和Ma 等[25]均使用主动型CLARITY 方法和共聚焦显微镜成像使完整的卵巢组织透明化，并借助特定标志物和计算机算法，揭示整个生殖生命周期中卵泡大小、位置、圆度、聚集和相互关系。Kagami 等[18]使用改良的CUBIC 组织透明化方法对小鼠卵巢卵泡进行三维评估，并观察发育卵泡中单个卵母细胞的三维定位。Rinaldi 等[22]使用ScaleS 组织透明化方法和共聚焦显微镜来研究小鼠卵巢的卵母细胞数量。2020 年McKey 等[27]发现iDISCO 联合CUBIC 是使荧光免疫组织化学标记的卵巢透明化的最佳方法，并使用光片显微镜生成完整的卵巢三维图像，对发育的各个阶段的卵泡进行了定性评估。Boateng 等[20]采用ScaleS 联合CUBIC 方法及多光子显微镜对小鼠卵巢组织进行透明化，并定性定量分析不同年龄阶段整个卵巢卵泡的发育情况，揭示卵巢卵母细胞储备的质量和数量。

区别于组织切片和免疫染色，上述研究团队都借助不同的组织透明化技术、光学成像技术以及抗体标记来描述卵泡发育全过程的三维结构，充分剖析了鼠类卵巢内部三维组织的分子细节，使完整卵巢的卵泡计数成为可能，并在卵泡生长的空间方面进行了可视化分析，可以从不同角度、深度和层面及整体定性定量观察卵泡的形态、数量、分布及生长状态。

2.1.2 鼠类卵巢细胞的减数分裂 Soygur 等[15]利用BABB 和CUBIC 方法使卵巢组织透明化，并用于区分非减数分裂和减数分裂生殖细胞的标志物TRA98和OCT4-GFP 来研究卵巢生殖细胞减数分裂的时空动态，打破传统组织切片中的RNA 原位杂交或免疫染色来了解卵巢生殖细胞减数分裂的认知。该研究还建立了减数分裂和表观遗传重编程之间的联系，猜测同步生殖细胞囊内细胞状态的转换可能是通过稀释表观遗传重编程的调节因子来完成，这引发学者们进一步思考关于细胞质共享对卵母细胞功能的影响以及其他细胞谱系（如胎盘或癌细胞）中细胞连接调节状态转换潜力的问题。由此可见，组织透明化技术、光学成像技术及整体荧光标记三者的结合打开了卵巢三维结构的大门，引发了学者们对于卵巢生殖细胞减数分裂等机制问题的探讨。

2.1.3 鼠类卵巢的脉管及神经系统 Svingen 等[13]利用BABB 透明化方法、传统荧光显微镜、共聚焦显微镜和光学投影断层扫描分析转基因卵巢，首次描绘了淋巴网络的时空模式分布图，为未来的研究奠定了基础。部分研究团队利用CLARITY 透明化方法和共聚焦显微镜探讨卵泡发生与卵巢脉管系统之间的关系[23-25]。Oren 等[26]则利用WOBLI 程序（基于CLARITY和ScaleA2）可视化卵巢脉管系统。虽然组织透明化和光学成像方法各不相同，但都展现可视化脉管的长度、直径、走行和数量等，动态反映脉管系统与卵巢组织的关系，为后续卵巢疾病治疗的靶向研究提供新思路。

McKey 等[27]结合iDISCO 和CUBIC 方法并使用ENDOMUCIN 抗体和TUJ1 抗体分别标记小鼠卵巢的血管和神经网络，以达到卵巢血管和神经的可视化。Tong 等[19]采用CUBIC 方法结合TH、CD31 标记小鼠卵巢的神经和血管网络进行三维成像，不仅观察到卵泡周围有丰富的血管，还观察到神经的生长速度与成熟卵泡的发育成正比，这表明卵泡发育和排卵不仅需要丰富的血液供应，还需要内在的神经支持，神经系统可能在刺激卵泡发育开始的敏感性中发挥作用。

2.2 人类卵巢新兴的组织透明化三维成像技术不仅应用在鼠类卵巢中，还有研究将其应用在人类卵巢癌组织中。鼠类卵巢脉管和神经系统成像相关研究使人类卵巢脉管和神经系统的成像成为可能，虽然目前只有个别研究将组织透明化三维成像技术应用于人类卵巢组织，但是这些研究已为人类疾病提供了传统二维组织学切片无法获得的新见解。Tanaka 等[16]利用iDISCO 透明化方法和抗体标记评估卵巢癌全身化疗反应，发现与ⅢB/C 期卵巢癌相比，ⅣA 期卵巢癌血管标志物CD34 的表达更不均一。这充分展现了三维可视化卵巢癌中肿瘤血管的异质性，为后续化疗药物的研究奠定基础，这是既往在传统的石蜡切片和冰冻切片中很难完成和获得的。该研究还绘制了卵巢癌患者生存情况与血管半径之间的关系图，这增加了卵巢癌治疗的预后和转归的可评估性。血管和淋巴管在人体发挥提供营养、维持体内新陈代谢及免疫功能的作用，神经则发挥支配作用。而恶性肿瘤往往会刺激异常血管的过度生长和肿瘤的淋巴转移，并扰乱正常的神经支配，因此可以借助组织透明化三维成像技术对卵巢癌的脉管和神经系统进行探索。这为卵巢癌治疗方案的制定提供了一个明确的思路，通过明确肿瘤细胞侵袭脉管、神经的机制开发药物阻断恶性肿瘤的脉管生长及神经浸润。

3 组织透明化三维成像技术在卵巢肿瘤中的应用可能

虽然卵巢的病理改变是复杂的三维结构，但目前仍在使用二维层面的苏木精-伊红、免疫组织化学、免疫荧光染色的薄石蜡切片或冰冻切片来进行卵巢的病理诊断。尽管Fiorentino 等[29]开发了一种显微CT 程序，该程序可以观察小鼠卵巢内部及主要卵巢动脉分支，并绘制所有类型卵泡的三维位置，做到真正的卵巢计算机三维重建，但直接用于卵巢病理的诊断仍有欠缺。目前，组织透明化和显微镜技术的快速发展与融合，使病理学家进入了三维解剖和病理的阶段。通过组织透明化和光学成像技术对正常和病理卵巢组织的全面成像，可显著提高对卵巢肿瘤的认识。

组织透明化三维成像技术在卵巢肿瘤病理诊断中具有很大的应用前景。第一，可进行临床病理诊断，确定卵巢肿瘤的病理类型及分级；第二，可探索卵巢肿瘤的转移及侵袭途径，进行卵巢肿瘤进展预测及预后评估；第三，可了解卵巢肿瘤生长的微环境（如脉管及神经系统），进一步研究卵巢肿瘤潜在的治疗靶点；第四，可评估卵巢肿瘤的耐药情况，分析铂类药物的疗效及药物传递等[5]。同时组织透明化三维成像技术优势显著，例如可以对完整的卵巢肿瘤样本进行成像，并增加成像深度，保护抗原表位，分析卵巢肿瘤三维结构及生长模式，并研究脉管和神经系统的密度、完整性和形态异质性等，为卵巢肿瘤的治疗及预后提供方向。但该技术仍面临很多未知的挑战，比如能可视化的组织的深度和厚度是一个难点，解决组织透明效率和进行快速多样抗体标记仍需探索；后期大容量图像、数据采集和分析处理也存在一定的挑战。组织透明化三维成像技术将会继续发展，新型透明试剂、免疫标记、显微镜设计以及大型数据集分析等方面的技术也会继续进步，相信该技术能打开卵巢肿瘤病理诊断的三维世界。

4 结语

目前，组织透明化三维成像技术已在哺乳动物的卵巢卵泡发育及其与脉管和神经系统的关系中有所研究及应用，使哺乳动物卵巢空间结构的三维可视化成为可能。随着技术的发展，组织透明化三维成像技术有望研究卵巢肿瘤三维结构及生长模式，并研究脉管和神经系统的密度、完整性和形态异质性等，从而绘制出复杂的卵巢肿瘤结构图，提供全新的卵巢肿瘤基本信息，更直观精确地进行病理诊断，为卵巢肿瘤的后续治疗提供新的思路。