化瘀无糖颗粒HPLC 指纹图谱研究

陈金娜，万齐越，刘向红

（山东大学齐鲁医院，山东 济南 250012）

化瘀无糖颗粒是由山东大学齐鲁医院经验方化瘀颗粒经工艺优化制成的无糖剂型［1］，由人参、蒲公英、土茯苓、漏芦、水蛭、柴胡、苍术、当归、蒲黄等13味中药组成。 方中人参苦甘而温，大补元气、生津养血，为君药；蒲公英配伍土茯苓、漏芦清热解毒、消痈散结，共为臣药；柴胡、郁金行气活血，蒲黄、当归补血活血止痛，水蛭破血消癥，牛膝逐瘀通经、引血下行，苍术健脾安胃，熟地黄补血滋阴，以上共为佐药；炙甘草补脾和胃，调和诸药，为使药。 诸药合用共奏补益正气、消肿散结之功效。 目前，化瘀无糖颗粒的质量控制方法为部分成分的定性定量检测［2］，而中药复方成分复杂，具有靶点多、整体协同等特点，单一组分或几种成分的定性定量分析无法准确、全面反映中药复方制剂的整体质量［3-4］。

中药色谱指纹图谱利用现代分析方法，以图、表、数据的形式综合、可量化地识别中药中的复杂成分，具有整体性和模糊性的特点，能更全面地反映中药化学成分的多样性和中药方剂功效的整体性，近几十年来在中药及其复方制剂质量控制中得到广泛应用［5-8］。 课题组首次采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）建立化瘀无糖颗粒指纹图谱，确定并指认共有峰，以期全面评价化瘀无糖颗粒制剂质量，为进一步研究其作用机制提供理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

分析天平（CP2250，奥豪斯国际贸易有限公司）、高效液相色谱仪（6CE，美国 Waters 公司）、Waters 2996 DAD 检测器、Empower600 色谱工作站、KDM型控温电热套（V1000 mL，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）、876-Ⅰ型真空干燥箱（南通科学仪器厂）、超声波清洗机（SK5200H）、旋转蒸发器（RE-52A，上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

次黄嘌呤（批号140661-200903）、咖啡酸（批号110885-200102）、香蒲新苷（批号 111573-200604）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（批号 111571-200604）、落新妇苷（批号 111798-201102）、人参皂苷 Rg1（批号110703-201027）、人参皂苷 Re（批号 110754-201123）、人参皂苷 Rb1（批号 110704-201122）、甘草酸铵（批号110731-201116）、柴胡皂苷 a（批号 110777-201108），均购自中国食品药品检定研究院。 化瘀无糖颗粒处方中13 味中药饮片购自山东中医药大学附属医院，12 批次（S1～S12）化瘀无糖颗粒样品由山东中医药大学附属医院制剂室制备。 乙腈、磷酸为色谱纯，余试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法

2.1 色谱条件

Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）（0～7 min，10%A；7～12 min，10%～15%A；12～18 min，15%A；18～23 min，15%～17%A；23～28 min，17%A；28～33 min，17%～18%A；33～38 min，18%A；38～43 min，18%～19%A；43～53 min，19%A；53～75 min，19%～29%A；75～80 min，29%A；80～100 min，29%～40%A；100～120 min，40%A）。 检测波长 203 nm，流速1.0 mL/min，进样量 10 μL，柱温 25 ℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取次黄嘌呤1.77 mg、咖啡酸 2.03 mg、香蒲新苷 1.96 mg、异鼠李素-3-O-新橙皮苷1.86 mg、落新妇苷2.06 mg、人参皂苷Rg12.55 mg、人参皂苷Re 2.82 mg、人参皂苷Rb12.93 mg、甘草酸铵1.72 mg、柴胡皂苷a 2.12 mg。上述对照品共置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容，作为混合对照品溶液。 次黄嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新妇苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草酸铵、柴胡皂苷a 的质量浓度分别为 70.8 μg/mL、81.2 μg/mL、78.4 μg/mL、74.4 μg/mL、82.4 μg/mL、102.0 μg/mL、112.8 μg/mL、117.2 μg/mL、68.8 μg/mL、84.8 μg/mL。

2.2.2 化瘀无糖颗粒样品溶液 精密称取化瘀无糖颗粒2.0 g，加入甲醇30 mL，于50 ℃加热回流30 min，滤过，精密量取续滤液15 mL，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加入水饱和正丁醇萃取3 次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，加入纯水洗涤3 次，每次30 mL，取正丁醇层蒸干，加入适量甲醇溶解，转移至2 mL 容量瓶中，定容，0.22 μm 微孔滤膜滤过，作为化瘀无糖颗粒样品溶液。

2.3 参照峰的选择

考察化瘀无糖颗粒HPLC 指纹图谱，所有色谱峰中10 号峰，即落新妇苷峰吸收强而稳定，峰面积大，分离效果良好，且落新妇苷是臣药土茯苓的指标成分［9］，也是药理活性成分［10-13］，因此选取 10 号峰为参照峰（S）。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取S1 样品按照2.2.2 项下方法制备样品溶液，以2.1 项下色谱条件连续进样6 次，以落新妇苷峰作为参照峰，计算各峰相对保留时间（tR）和相对峰面积。

2.4.2 稳定性试验 取S1 样品按照2.2.2 项下方法制备样品溶液，按 2.1 项下色谱条件分别在 0、2、4、8、12、24 h 依次进样测定，计算各峰tR和相对峰面积。

2.4.3 重复性试验 取S1 样品按照2.2.2 项下方法制备样品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，计算各峰tR和相对峰面积。

2.5 指纹图谱的建立与相似度评价

2.5.1 指纹图谱建立与分析 取化瘀无糖颗粒样品S1～S12 按照2.2.2 项下方法平行制备样品溶液，按照2.1 项下色谱条件测定混合对照品溶液和样品溶液，记录色谱图。

2.5.2 相似度评价 将所得指纹图谱导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系件”（2004A版），以对照谱图上标示的色谱峰作为匹配点，进行多点校正。

3 结果

3.1 方法学考察结果

精密度实验中，色谱图中各主要色谱峰tR的相对标准偏差（RSD）为0.04%～1.48%，相对峰面积RSD 为2.66%～4.82%，表明仪器精密度良好。 稳定性实验中，色谱图中各主要色谱峰tR的RSD 为0.03%～1.28%，相对峰面积的RSD 为2.30%～4.32%，表明样品溶液24 h 内稳定。 重复性实验中，色谱图中各主要色谱峰tR的RSD 为0.04%～0.72%，相对峰面积的RSD 为3.28%～4.80%，表明该方法重复性良好。见表1。

表1 化瘀无糖颗粒指纹图谱方法学考察结果（相对标准偏差）

（续）表1 化瘀无糖颗粒指纹图谱方法学考察结果（相对标准偏差）

3.2 化瘀无糖颗粒指纹图谱的建立

将12 批样品色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A 版），见图1。12 批样品中共标定21 个共有峰，其中10 个共有峰与对照品色谱图中的保留时间一致，可指认1、4、6、9、10、13、14、17、20、21 号峰分别为次黄嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新妇苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草酸铵、柴胡皂苷a，见图2。 其余11 个共有峰仍需进一步研究。 相似度评价结果显示，12 批样品指纹图谱的相似度值依次为 0.974、0.981、0.981、0.981、0.952、0.973、0.983、0.981、0.977、0.938、0.940、0.969， 平 均值为 0.9692，RSD 值为 1.69%（n=12），内在成分整体化学谱峰信息表明12 批化瘀无糖颗粒样品质量相对稳定。

图1 12 批化瘀无糖颗粒高效液相色谱指纹图谱叠加图（A）和对照指纹图谱（B）

图2 混合对照品高效液相色谱色谱图（A）及化瘀无糖颗粒高效液相色谱色谱图（B）

4 讨论

化瘀无糖颗粒为13 味药组成的中药复方制剂，其提取工艺为水煎煮提取法，成分复杂。 本实验考察了样品溶液制备方法，采集不同浓度的甲醇提取液进行HPLC 分析，存在杂质峰干扰严重、色谱峰分离效果较差等问题。 实验过程中发现采用甲醇回流、水饱和正丁醇萃取、纯水充分洗涤的方法可消除大部分干扰峰，实现较好的分离效果，且色谱峰信息较多，故选择此方法。

本实验考察了不同体积分数、不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水，乙腈-磷酸作为流动相时的色谱图保留时间和分离效果，比较各流动相系统等度洗脱和梯度洗脱模式，最终选定乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱。 通过DAD 检测器全波长（200～400 nm）扫描，可见203 nm 时检出峰信息较多，各峰分离效果较好，峰高比例适宜，基线较平稳，故本研究选择203 nm 为检测波长。

研究建立了化瘀无糖颗粒HPLC-DAD 指纹图谱检测分析方法，12 批化瘀无糖颗粒特征图谱有21个共有峰（相对保留时间RSD 均小于1%），指认特征峰 10 个，1、4、6、9、10、13、14、17、20、21 号峰分别对应的化学物质为次黄嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新妇苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草酸铵和柴胡皂苷a，其中10 号峰落新妇苷分离度好，最为稳定，选作参照峰。

首次建立的化瘀无糖颗粒HPLC-DAD 指纹图谱，图谱出峰数目、出峰强度及共有峰整体分离度等均表现良好，能够较全面地反映样品整体化学组分的信息特征。 化瘀无糖颗粒样品HPLC 指纹图谱的相似度计算结果显示，12 批样品相似度均大于0.938，使得制剂质量控制标准更为完善、合理，可用于该制剂质量的综合评价，为化瘀无糖颗粒作用机制研究提供理论基础，亦可为其他中药复方制剂建立HPLCDAD 指纹图谱分析方法提供参考。