不同活化剂强化超富集植物鬼针草吸收Cd 的比较分析

郭嘉航，李亚兰，杨 云,3，彭语欣，高紫云，孙世中，黄晶心*

(1. 云南师范大学高原特色中药材种植土壤质量演变退化与修复云南省野外科学观测研究站，昆明 650500；2. 云南师范大学云南省农村能源工程重点实验室，昆明 650500；3.文山州农业科学院，文山 663099)

土壤重金属污染是当今社会面临的巨大难题，其中镉（Cd）污染最为普遍也最为严重[1]。有研究报道，云南省某铅锌矿区周边土壤的Cd 的含量可达46.88 mg·kg-1，远高于全国土壤背景值[2]。根据调查，由于污染面源较广，工程修复经济损耗过大，这些土地一直处于抛荒地、废弃用地状态，如何高效生态地解决这种问题已经刻不容缓。目前对Cd 污染土壤的治理方法主要有物理修复、化学修复及植物修复，而植物修复对环境的扰动最小，无二次污染，经济简易，是土壤重金属污染修复的热门方案[3-4]。

重金属污染土壤中施加活化剂能通过萃取等方式使土壤中的重金属离子活化，提升植物修复土壤重金属污染的效率[5-6]。经查阅相关文献，N-双谷氨酸二乙酸四钠（GLDA）、聚天冬氨酸（PASP）、羟基乙叉二膦酸（HEDP）和十二烷基苯磺酸钠（LAS-30）是活化剂中对植物损伤小、对土壤中重金属提取能力强且降解产物生态友好的4 种活化剂[5,7-9]。如PASP对重金属Zn 和Cd 均具有较好的提取效果，提取率超过50%[10]，应用于植物后，能有效促进植物的生长[11]。重金属污染土壤中施加GLDA 能增强东南景天（Sedum alfredii）提取Cd、Zn 的能力，且提取效果比EDTA 更强[12]。吴青等[13]通过研究也证明，GLDA 对污泥中Cd 和Ni 的去除效果较好。HEDP不仅能活化土壤中的重金属[14]，且降解物中含有氮，具有营养植物的作用[15]。有关研究表明，低浓度的LAS 能缓解Cd 对黄豆（Glycine max）的毒害，促进其生长发育，使其生物量和富集重金属的量增加[16]。综上，向重金属污染土壤中添加PASP、HEDP、GLDA 和LAS 这4 种活化剂能增强土壤中重金属的溶解性，促进植物的生长，提升植物对重金属污染土壤的修复效率，具有治理效果好、稳定等特点，但在施加同等质量情况下，哪种活化剂产生的效果最好、最为经济、快捷还需进一步探究。

为解决上述问题，采用温室盆栽试验，选用Cd的超富集植物鬼针草（Bidens pilosa）作为模式种。鬼针草为菊科植物，具有生物量大、生长周期短、适应性广、耐性高等特点，不仅是Cd 的超富集植物，对铅也有高吸收性，还是砷的排异植物，具有综合修复重金属污染的能力[17-19]。经调查，在高浓度矿区土壤污染区域只有几种植物可以正常存活，鬼针草是其中1 种，这也是本次选取鬼针草作为模式种的原因。试验通过对比分析施加等量活化剂的情况下对植物产生的效应及植物从土壤中提取重金属的量，探究施加4 种活化剂对超富集植物吸收Cd的效果，为土壤重金属污染修复提供理论支撑，也为活化剂在植物修复土壤重金属污染方面的技术提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤材料 试验土壤采集于云南昆明呈贡区Cd 污染区域，土壤类型为黄棕壤。采用五点取样法采集栽培土壤样品，土壤在使用之前仔细去除杂物，过5 目筛，土壤经测定铵态氮含量为 3.242 mg·kg-1，硝态氮含量为12.367 mg·kg-1，pH 为7.23，电导率为4.4 S·m-1，土壤中Cd 含量为3.059 mg·kg-1。

1.1.2 试验试剂 选用GLDA、PASP、HEDP 和LAS-30 为试验材料，试剂选购于山东优索化工科技有限公司。GLDA 是新型的绿色可降解螯合剂，具有适用pH 范围广、耐高温、螯合能力强且无生态毒性的特点。PASP 是新型绿色处理剂，具有无磷、无毒、无公害和可完全生物降解特性，对离子有较强的螯合能力，在农业上可作为养分吸收增强剂，促进农作物的生产。HEDP 在高pH 下稳定，不易水解，对土壤中重金属具有较强的活化作用。LAS-30（十二烷基苯磺酸钠）是常用的阴离子表面活性乳化剂，低浓度施加能促进植物的生长[10,16,20-21]。

1.2 方法

取上述土壤混匀后分装于25 个上口径11 cm、高10 cm 的花盆中，每盆装土500 g，试验共设置5个处理组，包括对照组（CK）、GLDA 处理组、PASP处理组、HEDP 处理组和LAS-30 处理组，每个处理设置5 个重复。

将土壤装于花盆后，向每个花盆添加CdCl2溶液，添加的Cd 浓度为50 mg·kg-1，待土壤稳定后向花盆中种入鬼针草种子，每盆放置15 粒种子，待长出苗后，每盆挑选4 株留下，期间花盆放置于人工气候箱中，温度设置为白天25 ℃，夜晚18 ℃，光照强度为8 000 lx，保证每天10 h 光照和14 h 的黑暗处理。待每个花盆中鬼针草幼苗生长至6 ～ 7 cm，开始测量株高和叶绿素含量。

鬼针草生长至开花期（第120 天）以溶液形式向土壤中加入活化剂[20]，施加活化剂的量为0.5 g·kg-1，以淋洗方式分6 次每天加入，施加的总量为土壤质量的0.3%[22]，加入后定期测量株高，叶片叶绿素含量等指标。测量分为5 个测量周期（前期分生长期与繁殖期相互对照，后期以加入活化剂后鬼针草一周内的株高变化是否超过3 cm 为基准，若1周内鬼针草株高普遍生长大于3 cm，则默认出现变化；若1 周内鬼针草株高生长普遍小于3 cm，则默认未出现显著变化，继续等待，直至鬼针草出现显著变化。T1，第90 天，生长期，未开花；T2，第120 天，进入繁殖期，与生长期作对比；T3，第127天，刚完成活化剂的加入；T4，第134 天，加入活化剂1 周；T5，第148 天，加入活化剂3 周，鬼针草产生大量种子。

1.3 分析测定方法

1.3.1 土壤理化指标 土壤经晾晒烘干后过100 目筛，称取10 g 置于50 mL 锥形瓶，加入25 mL 去离子水，震荡2 h 充分混匀，静置后由土壤多参数速测仪（COMBI 5000. Germany ）测定土壤pH 与电导率（EC）值；

硝态氮与铵态氮含量根据标准 LY/T 1228—2015，用流动分析仪(AA3, Seal Analytical, ltd.Germany)进行测定；

土壤中Cd 含量采用7:2 的硝酸、氢氟酸进行微波消解，消解完成后赶酸，再用3%的稀硝酸将剩余液体定容至25 mL，过滤后用AA-7000 火焰法原子吸收仪测定溶液Cd 浓度；

植物中Cd 含量采用5:2 硝酸、过氧化氢进行微波消解，消解完成后赶酸，再用3%的稀硝酸将剩余液体定容至25 mL，过滤后用AA-7000 火焰法原子吸收仪测定溶液Cd 浓度。

1.3.2 生长指标的测定及植物的处理 叶片叶绿素含量的测定采用叶绿素仪（SPAD-502，北京海天友诚科技有限公司）。

收获方法：于收获前两天浇水，保持盆栽土壤湿润，保证收获鬼针草根系的完整性。收获前先测量株高（卷尺测量）、茎基直径（游标卡尺测量）和叶绿素含量。将整株鬼针草取出后，称取生物量，将根系剪下，测量根长，各组织经烘箱105 ℃杀青处理，再将其置于70 ℃烘干至恒重，烘干后测量干重。

1.3.3 数据与分析 采用SPSS19.0 软件对试验数据进行单因素方差分析、显著性分析和相关性分析，利用Excel 作图。3 个参数根据以下公式[22-23]计算。

2 结果与分析

2.1 不同活化剂处理对土壤理化指标的影响

对添加活化剂的土壤进行理化指标测定结果（表1）进行分析，发现施加4 种活化剂后土壤的电导率（EC）显著升高（P＜ 0.05），与对照组相比，GLDA、PASP、HEDP 和LAS-30 处理电导率分别升高了13.0%、22.4%、21.3%和27.1%。与对照组相比，HEDP 处理土壤的pH 显著降低，LAS-30 处理的pH 显著升高（P＜ 0.05），GLDA 与PASP 处理的土壤pH 未发生显著性变化，说明不同活化剂会对土壤pH 造成不同的影响。与对照组相比，LAS-30处理的土壤铵态氮（NH4+-N）含量显著升高（P＜0.05），其余处理组无显著性变化。施加活化剂后，各处理组的硝态氮含量降低，但无显著性变化，说明施加这4 种活化剂对土壤硝态氮的影响不大。

表1 不同处理下土壤的理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of soils under different treatments

2.2 不同活化剂处理对鬼针草株高的影响

通过对鬼针草5 个周期株高的测量，结果表明未添加活化剂时（T1—T2），鬼针草生长迅速，且株高相差不大，说明试验控制变量达到应有的效果，可进行下一步试验操作。鬼针草生长至开花期（T2）时，开始向土壤中加入活化剂（T2—T3），此时鬼针草生长均变缓慢，LAS-30 处理组出现致死现象，到T3 时完全枯萎，说明LAS-30 对鬼针草有一定的毒害作用；相比于对照组，施加GLDA、PASP 和HEDP 处理的鬼针草株高均显著升高（P＜ 0.05），分别增加了6.5%、5.6%和14.1%，说明施加这3 种活化剂能促进鬼针草的生长。加入活化剂后（T3—T5），鬼针草株高的变化趋势相同，其中，对鬼针草株高促进效果最佳的HEDP 处理，说明活化剂加入后并不会随时间的延长对鬼针草株高的生长产生不同的效果。

图1 不同活化剂处理下鬼针草的株高变化Figure 1 Changes of plant height of B. Pilosa with application of different activators

2.3 不同活化剂处理对鬼针草叶绿素含量的影响

由图2 可知，土壤中未添加活化剂（T1—T2）时，鬼针草叶片叶绿素含量无显著性差异。开花期（T2）加入活化剂后，施加GLDA 与PASP 处理的鬼针草叶片叶绿素含量均显著高于对照组（P＜0.05），说明这2 种活化剂的添加能促进鬼针草叶片叶绿素的合成，其中，施加GLDA 处理随时间的延长，促进效果会逐渐增加，PASP 则逐渐趋于平缓；施加HEDP 处理的鬼针草叶片的叶绿素含量与对照组无显著性差异，施加LAS-30 处理的鬼针草叶片叶绿素显著降低（P＜ 0.05），说明LAS-30 对鬼针草叶片叶绿素的合成存在抑制作用。

图2 不同活化剂处理下鬼针草叶片的叶绿素含量变化Figure 2 Changes of chlorophyll content in leaves of B. pilosa with application of different activators

2.4 不同活化剂处理对鬼针草各部位重金属Cd 含量的影响

由图3 可知，与对照组相比，施加活化剂GLDA、HEDP 和PASP 后，鬼针草根部富集Cd 的量显著升高（P＜ 0.05），是对照组的1.15 倍、1.12倍和1.09 倍。茎对Cd 的富集PASP 处理最高，HEDP处理次之，均高于对照组，GLDA 处理茎部对Cd的富集量最低。与对照组相比，GLDA、PASP、HEDP和LAS-30 处理鬼针草叶片对Cd的富集均高于对照组，是对照组的2.41 倍、1.30 倍、1.06 倍和1.22倍。GLDA 处理鬼针草花果对Cd 的富集最高，是对照组的1.58 倍。综上，4 种活化剂对鬼针草各部位富集Cd 的量有不同的影响，其中，PASP 与HEDP处理鬼针草各部位富集重金属的量均高于对照组，说明PASP 与HEDP 处理能提高Cd 污染土壤中鬼针草对Cd 的富集。

图3 不同处理下鬼针草各部位Cd 的含量Figure 3 Cadmium contents in different parts of B. pilosa under different treatments

2.5 不同活化剂处理对鬼针草各部位生物量与吸收重金属量的影响

由图4（a）可知，与对照组相比，GLDA、PASP和HEDP 处理鬼针草的地上与地下生物量干重均升高，地上部分分别提升了16.7%、56.5%和16.1%，地下部分分别提升了10.4%、43.7%和12.7%，说明在Cd 污染土壤中施加GLDA、PASP 和HEDP 对鬼针草生物量的提升具有促进作用。由图4（b）可知，GLDA、PASP 和HEDP 处理鬼针草地上与地下部分吸收重金属Cd 的量均升高，与对照组相比，地上部分分别提升了77.7%、97.3%和25.6%，地下部分分别提升了25.9%、56.4%和25.7%，说明Cd 污染土壤中施加GLDA、PASP 和HEDP 能促进鬼针草对Cd 的吸收。

图4 不同处理对鬼针草地上与地下部分生物量和吸收Cd 含量的影响Figure 4 Effects of different treatments on biomass and Cd uptake of aboveground and underground parts of B. pilosa

2.6 不同活化剂处理对鬼针草干重与各部位吸收Cd 含量的分配

由图5（a）可知，LAS-30 处理鬼针草地下部分生物量干重的分配比例最高，与其他处理存在显著性差异（P＜ 0.05），地上部分生物量干重的分配比例LAS-30 处理最低，显著低于其他处理组（P＜0.05）。由图5（b）可以看出，对照组与HEDP 处理的鬼针草地下部分吸收Cd 的量分配比例显著高于其他处理组（P＜ 0.05），GLDA、PASP 和LAS-30处理鬼针草地上部分吸收Cd 的量分配比例显著高于其他处理组（P＜ 0.05），说明这3 种活化剂的添加能促进鬼针草地上部Cd 的富集。

图5 不同处理下鬼针草干重与各部位吸收Cd 含量的分配比例Figure 5 The proportion of dry weight and the amount of Cd absorbed by different parts in different treatments

2.7 不同活化剂处理对鬼针草富集系数、转运比值和净化率的影响

由表2 可知，不同处理组鬼针草的富集系数均为地下部分大于地上部分，GLDA、PASP 和HEDP处理鬼针草的地上与地下部分富集系数均显著高于对照组（P ＜0.05），说明向Cd 污染土壤中施加GLDA、PASP 和HEDP 能促进鬼针草对土壤中Cd的富集。鬼针草的转运比值GLDA 处理最高，对照组与HEDP 处理最低，说明施加GLDA 与PASP 能促进鬼针草地下部分Cd 向地上部分的转运，转运效果最好的为GLDA 处理。由鬼针草对土壤的净化率，施加GLDA、PASP 和HEDP 处理对Cd 污染土壤的净化率均显著高于对照组（P ＜0.05），效果最好的为PASP 处理，3 种活化剂对土壤的净化率分别为对照组的1.57 倍、1.81 倍和1.26 倍，说明Cd污染土壤中施加GLDA、HEDP 与PASP 能促进鬼针草对Cd 污染土壤的净化。

表2 不同活化剂处理下鬼针草对Cd 的富集系数、转运比值与土壤净化率Table 2 Enrichment coefficients, transport coefficients to Cd and soil purification rates of B. pilosa with application of different activators

3 讨论

3.1 施用4 种活化剂能改善土壤营养状况

土壤中施加不同活化剂会对土壤的理化指标产生不同的影响。施加4 种活化剂后土壤的电导率均显著升高（P＜ 0.05）（表1），这可能是由于活化剂活化土壤中重金属离子和其他矿物质离子，使土壤中可吸收态重金属离子和其他矿物质离子含量增多，导致土壤的电导率升高[24-25]。施加GLDA、PASP与LAS-30 后土壤pH 值升高，施加HEDP 后土壤pH 值降低（P＜ 0.05），一方面这可能与活化剂本身性质有关，GLDA、PASP 和LSA-30 是碱性活化剂，pH 均大于8，施加后使土壤偏碱性，HEDP 是一种酸性活化剂，施加后使土壤的pH 降低；另一方面可能与植物根系分泌物有关。有研究表明，植物根系分泌物能使植物根际土壤pH 发生变化[26]，这能进一步促进植物对重金属的吸收。本研究中，与对照组相比，施加GLDA、PASP 及LAS-30 后土壤中的铵态氮含量升高（表1），说明施加这3 种活化剂能活化土壤中的N 含量，使植物可利用的N 营养物质增多。有关研究还表明，PASP 含有丰富的酰胺键及羧基等极性基团，可作为土壤的保水剂，同时还能抑制土壤中铵态氮氮肥的挥发，促进土壤中微量元素的溶解，产生更多有利于土壤生物生存的元素，使土壤肥力得到改善[27]，这对活化剂在植物修复土壤重金属污染领域的运用提供了理论参考。

3.2 施加活化剂能促进植物的生长及生物量的增加，改善植物生长状况

植物对Cd 无专一吸收通道，它可能是经Fe、Zn 或Ca 通道进入根细胞[28]，Cd 进入植物细胞后，会抑制植物叶片叶绿素等的合成，破坏植物叶片的结构，对植物的光合生理造成严重影响[29-31]。在本研究中，施加活化剂后，鬼针草叶片的叶绿素含量发生显著变化，GLDA 与PASP 处理的鬼针草叶片叶绿素含量显著高于对照组（P＜ 0.05），施加HEDP处理的鬼针草叶片的叶绿素含量与对照组无显著性差异，一方面可能是因为GLDA 和PASP 降解产生营养物质，使得鬼针草获取的营养物质增加，能合成更多的叶绿素；另一方面可能是施加这两种活化剂后活化了土壤中的营养物质，使得鬼针草能从土壤中获取更多的养分抵抗Cd 胁迫，使得叶绿素合成增加[32-33]。施加LAS-30 处理组的鬼针草出现致死现象，使生物量与吸收Cd 的含量下降，这可能与施加活化剂的浓度有关。陈玉成等[34]的研究中表明，LAS-30 对土壤中重金属阳离子具有增溶增流作用，能促进植物对重金属的吸收，但浓度过高会破坏植物细胞活性，对植物产生负面效应，导致植物死亡，这也与刘红玉等[35]使用LAS 处理蚕豆根尖的研究结果一致：施用LAS 后，蚕豆根尖透明度增加，细胞内Cd 含量增加，导致蚕豆生长受到阻碍。本研究中，施加PASP 不仅使鬼针草株高、叶绿素含量、茎基直径、生物量等升高，也使得鬼针草对Cd的富集效果提升，这与张鑫等[36]的盆栽试验研究结果一致。这是因为PASP 是由C、H、O 和N 等4种元素组成的氨基酸聚合物，生物降解性好，对生物无毒性，既可作为肥料增效剂，还对金属离子具有螯合作用，也可富集氮、磷、钾及微量元素供给植物，使植物更有效地利用肥料，提高植物的产量和品质[10,37]。HEDP 与GLDA 修复Cd 污染土壤的研究在国内研究较少，试验表明这两种活化剂作为新型螯合剂，经济适宜的同时，可提高鬼针草生物量和对Cd的提取率，达到对Cd 污染土壤的修复效果[25,33,38]。

3.3 施加4 种活化剂能增强鬼针草对Cd 污染土壤的修复效果

施加活化剂能促进植物对土壤中Cd 的吸收效率，提升土壤的净化率。在本研究中，与对照组相比，GLDA、HEDP 和PASP 活化剂添加到Cd 污染土壤中后，鬼针草吸收土壤中Cd 的量均显著增加，土壤的净化率提高。研究表明，GLDA、PASP、HEDP等活化剂具有分子、原子或离子化合物提供配位电子对，能够与具有空轨道的金属离子结合成为配位键，使土壤中Cd 的生物有效性提高，LAS-30 与土壤接触后，能与重金属离子经过交换或络合反应，使难溶态的Cd 从土壤中释放出来[22,39-40]，因此土壤中可吸收态的Cd 离子增多，植物对Cd 的吸收量增加。植物对Cd 的转运比值反映了植物将Cd 从地下部分转移到地上部分的能力，本研究中，施加4种活化剂后鬼针草的转运比值均升高，说明施加这4 种活化剂能促进植物对土壤中Cd 的转移，提升土壤的净化率。本研究还表明，不同的活化剂对鬼针草各部位吸收Cd 的效果不同，PASP 处理对鬼针草茎的Cd 积累促进效果最好，GLDA 处理对根、叶和花果的Cd 积累促进效果最好，这可能与不同的活化剂降解产生不同的养分或对土壤活化养分的种类不同有关，使鬼针草各部位富集Cd 的量存在较大的差距。施用活化剂后单株鬼针草对土壤的净化率均升高。一方面这与鬼针草生物量增加，使鬼针草从土壤中吸收Cd 离子也增多有关，另一方面可能与活化剂活化了土壤中的Cd，使植物能从土壤中吸收更多Cd 离子，最终使土壤的净化率提升[32,38]；其中，对净化率提升作用最强的为PASP 处理，与对照组相比，其净化率提升了1.7 倍。对4 种活化剂的净化效果分析，发现PASP 不仅能改善土壤养分状况，且对土壤净化效果的促进作用明显，具备了修复Cd 污染土壤潜力，但目前鲜少有人将之运用于土壤重金属修复领域。本研究为PASP 在重金属土壤污染修复领域的运用提供了重要理论参考。

4 结论

本研究选用4 种新型活化剂为研究对象，通过对4 种活化剂的应用效果对比分析，活化剂的施加能通过影响土壤的理化性质，使鬼针草生物量增加，富集土壤中更多的Cd，提升土壤的净化率。其中，HEDP、PASP 和GLDA 处理相比于对照组，地上部分生物量分别提升了77.7%、97.3%和25.6%；相比于对照组的净化率2.46%，PASP、GLDA 和HEDP处理对土壤净化率分别为4.85%、4.37%和3.08%。综上，Cd 污染土壤中施加活化剂能通过改善土壤养分状况，使鬼针草叶绿素含量、株高和生物量增加，增强鬼针草对Cd 的富集，使鬼针草对土壤中Cd 的净化效率提升，效果最好的为PASP 处理。结果可为活化剂在矿区、抛荒地等严重Cd 污染土壤的植物修复领域的应用提供了重要的理论参考。