水稻芽期耐盐性综合评价与筛选

林泉祥，宋远辉，花 芹，欧阳晨林，孙家猛，张海涛

(安徽农业大学农学院，合肥 230036)

水稻(Oryza sativaL.)是世界上主要的粮食作物之一，是超50%人口日常饮食中最重要和最广泛的碳水化合物来源（约占卡路里摄入量的50% ～ 80%）[1]。受全球人口的增长和温室效应加剧、耕作灌溉方式不完善等问题的制约，土壤盐渍化作为环境因子进程呈持续上升趋势，通常在作物的生长和生产能力表现出渗透胁迫、离子毒性和营养缺乏等不利影响[2]。尤其过度使用化肥和土壤改良剂、排水不当、海水侵蚀等都加剧了土壤中 NaCl、CaSO4、MgSO4、Mg(HCO3)2和Ca(HCO3)2等的积累。目前，全球超过20%的耕地（约8×106km2）受到土壤盐渍化的影响，直接威胁粮食安全[3]。盐胁迫导致Na+与K+竞争，使K+从细胞膜中渗漏，造成离子稳态失衡，从而阻碍光合作用并产生过量的ROS，最终导致生长减缓与细胞死亡[4]。对水稻耐盐性基因SKC1的研究表明，该基因编码一个定位在细胞膜上的Na+转运蛋白，当水稻茎秆中有过多的Na+时，Na+转运蛋白开始工作，能够将细胞内多余的Na+运往地下部，减轻毒害[5]。Zhang 等[6]报道的一个拟南芥CPK12基因，与野生型相比，CPK12-RNAi突变体在幼苗期对盐胁迫更敏感，H2O2含量显著增加，表明CPK12参与到植物对盐胁迫调控中。 Kim 等[7]报道了一个盐胁迫基因OsDHSRP1，在盐胁迫条件下，使OsGLYI-11.2 和OsACP1 蛋白泛素化，并通过UB/26S 蛋白酶体系降解, 从而导致细胞内甲基乙二醛增加和降低MDA 酶含量，影响种子萌发。Raina等[8]报道一个能有效增强作物光合效率，清除体内ROS，降低对细胞膜系统的损伤基因StCaM2，该基因有效提高了作物的耐盐性。水稻的耐盐性受到数量性状位点(quantitative trait locus, QTL）调控，借助相关的QTL 位点进行分子标记的辅助选择，可以加快耐盐品种的选育[9]。Noushin[10]通过构建93-11 与Pei-ai64s 的重组自交系，对132 个自交系进行盐胁迫相关的QTL分析，检测到一个控制芽生长相关的QTL位点qSL7，该位点内包含一个编码K+离子转运的转录因子，在水稻盐胁迫下对茎长调控发挥重要作用。

水稻作为中度盐敏感作物，在萌发期、分蘖期和成熟期具有较强的耐盐性，而在幼苗期和生殖期高度敏感[11]。土壤盐渍化对水稻发芽的影响主要表现对发芽势、整齐度及生长造成负面效应。因此，幼苗期耐盐性是盐渍土条件下保证水稻稳产的重要影响因素，直接影响营养生长和生殖生长阶段[12-14]。相比于成熟期，对水稻幼苗期进行耐盐性考察，成本低，操作简单易行[15]。Chen 等[16]研究表明，盐胁迫下的水稻种子活力跟对照出现明显差异，表现为发芽率明显降低，幼苗芽和根的长度都明显缩短。因此，要削弱土壤盐渍化对水稻产量的影响，大力“改土消盐”的同时，筛选耐盐性强的种质资源、培育出耐盐和高产的新品种尤为重要。在过去的几十年里，对水稻耐种质资源的耐盐性评价多是采用统计学方面、聚类分析[17]、隶属函数[18]等简单分析，对水稻种质资源进行耐盐性分级往往不具有全面性。作者以来自中国农业科学研究院种质资源库60份水稻品种(系)作为试验对象，采用0.3%、0.5%和0.7% NaCl 盐浓度模拟大田盐环境，通过测定发芽势、发芽率、根长、苗鲜重、苗干重、根鲜重、根干重、MDA 和耐盐等级指标来评价水稻品种(系)的耐盐性，建立基于发芽指数法、加权隶属函数法等多元统计方法的水稻耐盐鉴定体系，为育种家选育耐盐水稻品种提供优质的种质资源和理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究所用的60 个水稻品种（系）均由中国农业科学研究院种质资源库保存。

1.2 试验设计

本试验于2017—2021 年在安徽农业大学农学院水稻分子育种实验室进行。利用9311 和日本晴作为初期筛选种子萌发期和幼苗期耐盐性适宜浓度，进行盐胁迫预备试验NaCl 溶液浓度为0 ～ 10% (梯度为1%)，测量发芽势、发芽率和干鲜重。当 NaCl浓度为0.3%、0.5%和0.7%时(pH 6.98)，水稻的生长指标差异最为明显，因此将这3 个处理浓度作为后续研究。选取60 份水稻品种（系）发育饱满、整齐、健康种子置于45 ℃恒温箱处理48 h 破除休眠，1% 次氯酸钠溶液消毒20 min，用ddH2O 反复冲洗干净。设置1 个空白对照与0.3%、0.5%和0.7%（pH 6.98）的3 个NaCl 浓度梯度，每个处理3 次重复（每个重复50 粒）。种子均匀放置在铺有无菌滤纸的9 cm 规格的玻璃培养皿，置于智能人工气候箱(RXZ-50CD 型，浙江宁波江南仪器厂)，在28 ℃条件下暗培养3 d 后，在培养条件为30 ℃/12 h、4 000 lx；25 ℃/12 h、黑暗条件下培养4 d。相同时间段内对种子进行观察统计，每1 d 更换1 次培养液（参照国际水稻所的标准营养液），保证各处理间的盐浓度与pH 稳定。

1.3 指标测定及计算方法

参照农作物检验规程 GB/T3543.1—3543.7（1995 版），当种子胚根长度达到种子长度，胚芽达到种子长度一半作为发芽标准。胁迫处理第4 天调查各水稻品种的发芽势；第7 天调查各水稻品种的发芽率；第7天在处理中抽取10粒长势一致种子，测量各种子的胚芽长、胚根长以及根数。测定对照与高盐浓度下的鲜重与干重，超纯水冲洗根部，用吸水纸吸去多余水分后测量鲜重；幼苗高温（105 ℃）20 min 杀青，75 ℃烘至恒重后测量干重；丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法测定。候选种质资源的耐盐性分析，以发芽势、发芽率、相对芽长、相对根长、根数、相对发芽势、相对发芽率以及相对盐害率作为水稻耐盐性的综合评价指标。各指标计算方式如下：

水稻品种的耐盐性强弱区分，采用模糊函数法获得60 份水稻种质资源的隶属度，根据隶属度大小把水稻品种分为6 个等级。计算隶属度的公式如下:

其中，公式内X表示某一生长指标处理测定值的相对值，分别用Xmax、Xmin来表示测定值的最大值与最小值。计算各生长指标的隶属值时，根据生长指标与抗性的相关性采取不同的计算公式，呈正相关采用( 1 )式，呈负相关采用( 2 )式。计算所得X(u)即作为该生长指标的抗逆隶属值，品种所有生长指标的抗逆隶属值的平均值作为该品种的抗逆隶属度，并用于水稻种质资源耐盐性的分级。

1.4 数据处理

数据统计应用Excel 2016 分析软件，方差分析、相关分析及聚类分析利用SPSS20.0 分析软件。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对水稻萌发的影响

为保证耐盐种质筛选的可靠性，根据60 份种质资源在0.3%、0.5%和0.7% NaCl 浓度的初筛结果，选取发芽率分别为88.16%和88.75%的9311 和水原295 作为耐盐品种；发芽率分别为15.09%和18.75%的日本晴和大空作为盐敏感品种。利用不同浓度的NaCl 溶液对两个耐盐品种和两个盐敏感品种进行处理，结果表明，随着NaCl 浓度的逐步提高（表1），耐盐种质的相对发芽率在0.3%和0.5%水平下胁迫4 d 和7 d 均不具有差异性，在0.7%浓度下具有极显著差异，相对发芽率降低20.65%；而盐敏感种质的相对发芽率在0.3%、0.5%和0.7%盐胁迫下均具有显著性差异，在0.7%浓度下种子萌发率只为正常的17.94%。相对盐害率4 d 时，耐盐和盐敏感均具有极显著差异，当盐浓度大于0.5%时，相对盐害率均超过了60%，然而耐盐和盐敏感种质的相对盐害率在胁迫处理7 d 后并无显著差异，因此盐胁迫对水稻发芽的影响主要表现在发芽速度，而并不减弱种子的生活力。 耐盐种质的相对芽长在0.3%、0.5%和0.7%3 个浓度下具有显著差异，而盐敏感种质在0.5%浓度后具有极显著影响，相对芽长均小于40%。耐盐种质和盐敏感种质的根长在盐胁迫条件下均受到了显著影响，相对根长均小于60%；耐盐种质的相对侧根数在盐胁迫条件下并无显著影响，然而盐敏感种质的相对侧根数在盐浓度大于0.5%时，抑制率达到极显著，相对侧根数仅为正常的27%。

表1 不同浓度NaCl 胁迫条件下耐盐和盐敏感品种在芽期各评价指标表现Table 1 Phenotypic values of salt-tolerant and sensitive rice varieties under different NaCl concentrations at seedling germination stage

2.2 盐胁迫对水稻苗期生长的影响

在0.7% NaCl 处理的盐胁迫下，与对照相比，60 份水稻种质的根长、芽长、总鲜重、总干重均有下降（表 2）。胁迫抑制程度从大到小依次为鲜重(49.21%)、干重(40.00%)、芽长(20.76%)和根长(15.21%)。0.7% NaCl 处理的盐胁迫下鲜重和干重的变异系数值分别为59.38%和66.67%，显著大于对照处理下鲜重和干重变异系数47.62%和40.00%。此外，不同种质间差异显著，耐盐品种农垦58 的根长与芽长的变化幅度为-1.75%与4.39%，极显著小于盐敏感品种日本晴的26.34%与29.73%，表明耐盐品种能够有效抵御盐胁迫带来的危害。然而，对照处理的平均干鲜比为16.39%，显著低于0.7%NaCl 处理的21.02%，表明干物质的积累有助于植物响应盐胁迫，但具体代谢路径还需进一步探究。

表2 水稻品种在对照处理与胁迫处理下的生长状况Table 2 Growth status of rice varieties under control and stress treatments

2.3 盐胁迫处理下各单项指标与苗期耐盐级别的相关系数矩阵

相关性分析结果表明，相对发芽率、相对芽长、相对根长和相对根数均与NaCl 浓度呈显著负相关，相关系数均在-0.38 以上，其中盐胁迫后相对根长与NaCl 浓度的相关系数最大，为-0.691；相对盐害率与 NaCl 浓度呈极显著正相关，相对盐害率（4 d）的相关系数比相对盐害率（7 d）的大（表 3），表明了盐溶液对种子萌发早期的抑制效应更强。除相对根数外，相对盐害率与相对根长、相对芽长、相对根数、相对发芽率均呈负相关，但相对根数与相对盐害率未达到显著水平；其中相对盐害率（4 d）与相对发芽率（4 d）达到极显著水平，其相关系数最大，为-1.000。在发芽试验中，除发芽率外，芽长与根长是种子活力的最直观表现。相对芽长与相对根长在各项生理指标的相关性除相对根数上出现差异，其余均有显著关系。相对芽长与其他指标间除相对根数外均达到极显著水平，且与相对发芽率（7 d）相关系数最高，达到0.684。此外，盐浓度与相对芽长和相对根长的相关系数分别为-0.477与-0.691，盐浓度与相对根长的相关系数最大，表明在不同盐浓度下种质的根较芽生长，盐胁迫抑制效果更明显。

表3 盐胁迫下水稻幼苗期各生长指标的相关系数分析Table 3 Pearson correlation coefficients among evaluated traits in rice under salt treatment

2.4 盐碱胁迫下不同水稻品种萌发期的耐盐级别分类

根据盐胁迫下水稻苗期耐盐性状相关分析结果可以看出，很多性状间存在着不同程度的相关性，即各耐盐性状系数信息有着不同程度的重叠，而无法根据一两个指标确定该性状。因此，需要对该性状进行综合分析。综合各种质萌发期的各项指标，运用隶属函数法计算隶属度后进行聚类分析，所得隶属值大小客观反应各品种（系）芽期耐盐能力的大小，数值越大说明耐盐能力越强。本研究根据各生长指标的平均抗逆隶属值做为品种间的隶属度用于60 份种质耐盐性的分级标准。借助隶属度大小将水稻种质分为6 个等级，分别是隶属度在0.85 以上的高抗（HT）、隶属度在0.7 以上的中抗（MT）、隶属度在0.55 以上的低抗（T）、隶属度在0.4 以上的敏感（S）、隶属度在0.3 以上的中度敏感（MS）与隶属度在0.3 以下的高度敏感（HS）。60 份种质分级见表4，其中表现耐盐的品种主要有IR50、Bate Aus、Bhat Mukhu、水原295、9311 和L201，其隶属值均在0.85 以上；敏感的品种有IRAT109 和TAE GU NA ，其隶属值均在0.3 以下。

表4 盐碱胁迫下水稻耐盐性和耐级别分类Table 4 Varieties classified with respect to membership degree (MD) under NaCl treatments

当作物处于高盐浓度环境下，体内积累的超氧自由基会导致细胞过氧化造成作物生物膜破损。为反映作物体内的细胞过氧化程度，通常借用细胞过氧化产物丙二醛（MDA）的含量表示[21]。在6 个等级的水稻种质随机抽取一个品种进行MDA 测定（表5），发现随着耐盐能力的下降，盐敏感品种的MDA 含量显著高于耐盐品种含量（相对含量升高97.46%）。结果表明，在盐胁迫下，耐盐品种对于自身生物膜的保护能力即清除超氧自由基能力强于盐敏感品种，保证自身正常生长。

表5 不同等级水稻品种在NaCl 处理下MDA 含量Table 5 MDA contents in rice varieties treated with different NaCl grades

3 讨论

3.1 盐胁迫对不同耐盐性水稻种质萌发的影响

种子的萌发和早期幼苗的生长是植物生长关键阶段，是决定种子在盐碱地上出苗量和出苗整齐度的关键[22]。本研究在对60 份水稻种质的发芽试验中发现，盐胁迫处理下的各种质种子萌动时间与对照处理相比延迟了12～48 h；空白对照下的各种质发芽时间为72～96 h，盐胁迫处理下的发芽时间出现了36 h 的延迟。萌动与发芽时间的延迟伴随着盐处理浓度的上升而延迟，在盐敏感种质中的表现最为明显。如TAE GU NA 在盐胁迫7 d 时相对发芽率仅为52.83%，表明种子早期萌发在盐胁迫处理下受到严重抑制。水稻的萌发需要保证光照、温度、水分以及土壤离子浓度均在水稻生长适宜的范围内。土壤中的盐含量是水稻生长受限制的因素之一，高浓度盐含量抑制水稻正常生长，严重时导致水稻的死亡。盐胁迫处理造成水稻的发芽率、根长、芽长、鲜重、干重等低于对照处理[23]。水稻吸收水分和营养元素的主要途径是根，根系的发育决定水稻的生长。盐胁迫处理时，水稻的根系生长首先受到抑制，随后影响水稻的地上部生长。水稻种质在萌发过程中根系受盐毒害的变化最大（表3），相对根长与相对盐害率（4 d）的相关系数为-0.549，表明盐胁迫下水稻种质的根发育受到胁迫影响，主要表现在对主根的伸长和侧根形成的抑制效果[24]。典型耐盐种质的相对根长和相对侧根数极显著大于盐敏感种质（图1），特别是大空稻在0.7%浓度下，根的伸长几乎完全被抑制，说明盐胁迫通过抑制根的伸长及发生来影响水稻幼苗对水分的吸收；而胁迫7 d 不同种质的相对芽长在不同浓度下虽影响显著，但在同盐浓度下无显著影响，表明水稻种子萌发时根的伸长对盐胁迫最为敏感，芽次之，这与前人的研究结果一致[25]。

图1 NaCl 胁迫条件下7 d 典型和盐敏感水稻种质资源的表现型比较Figure 1 Comparison of the phenotypes of salt-tolerant and salt-sensitive rice germplasm accessions under different treatments for seven days in germination and seedling stages

3.2 耐盐性鉴定的统计分析

对大麦、小麦、水稻、玉米等种质资源进行耐盐性筛选时，国内外学者常常借用发芽势、发芽率、芽长和根长等常见的生长指标作为评价种质资源的耐盐性标准[26]，但国内外对耐盐性评价的标准生理指标未进行统一，造成种质资源的耐盐性分级不一致。种质资源的耐盐性是作物的一个复杂性状，受到来自外界环境与自身基因型的影响，在此基础上借助简单的指标对种质资源的耐盐性分级，难以正确表现种质资源本身的耐盐能力[27]。为客观反映各种质资源的耐盐性能力强弱，本研究对常见的耐盐性评价指标进行相关性分析和多元统计分析，同时结合隶属函数等方法，获得综合评价值隶属度，借助隶属度大小将60 份水稻种质资源根据耐盐性强弱划分成6 个等级，包括高抗品种、中抗品种、低抗品种、敏感品种、中度敏感品种和高度敏感品种。利用该评价体系，在相同的胁迫条件下，预测目标种质耐盐性的强弱，为水稻耐盐育种及资源筛选提供参考。

4 结论

环境变化在水稻的日常生长过程中起着十分关键的作用，水稻产量的最终制约因素就是土壤中的盐分含量。在人工气候箱内，我们通过3 个梯度的NaCl 溶液对供试的种质资源进行耐盐性鉴定，并利用综合评价隶属度对供试材料进行分级。本研究共获得6 份高度耐盐的水稻品种、16 份中度耐盐的水稻品种、19 份低度耐盐水稻品种、13 份盐敏感水稻品种、4 份中度盐敏感水稻品种和2 份高度盐敏感水稻品种。研究结果可为日后的水稻耐盐种质资源的筛选和鉴定、为后续盐胁迫相关基因定位和品种选育研究奠定基础，以及对日益严重的土壤盐碱问题提供新的解决思路和和基础材料。

致谢：感谢中国农业科学院作物科学研究所国家水稻种质资源中期库为本研究提供水稻种质资源，感谢《安徽农业大学学报》编辑部老师在论文修改中给予的帮助。