新疆190份棉花材料的遗传多样性评价

权永刚，姜辉，武晓刚，杨恒超，蔺怀龙，常宝学，郭建强，陈爱民

(1.九圣禾种业股份有限公司，新疆 昌吉 831100；2.农业农村部西北内陆棉花品种创制重点实验室，新疆 昌吉 831100)

棉花是我国重要的经济作物和纺织工业原料，在国民经济中具有不可替代的地位。根据棉花种植区域的生态条件以及生产的特点，我国棉花生产主要集中在黄河流域、长江流域和西北内陆三大棉区。近年来，随着国内外经济形势的变化和国家产业政策的调整，我国棉花生产区域化，种植面积在长江流域和黄河流域大幅下滑，机械化水平较高的新疆成为我国主产棉区，也是我国唯一的长绒棉产区，其棉花种植面积和产量达到全国的80%以上。随着棉花产业形势的发展，中国培育和审定棉花新品种的速度快且数量多，而棉花长期遗传定向改良，骨干亲本数量有限且反复集中利用，导致新疆棉花品种的遗传基础较为单一，遗传差异越来越小，完全依据传统生物学形态特征进行棉花品种的辨别和分类越来越困难。同时，推向大田生产的速度也在加快，导致新疆种子市场“混、杂、乱”现象突出，严重阻碍了棉花产业的健康持续发展。

分子标记因不受环境影响且可以从 DNA分子层面上反映出生物个体间的遗传差异而被广泛应用。目前，在植物育种中使用的分子标记很多，其中，SSR标记(简单重复序列，Simple Sequence Repeat)因其多态性丰富，遗传上呈共显性， 重复性好，且覆盖整个基因组的编码区和非编码区，目前已被广泛用于作物品种指纹图谱构建和遗传多样性分析中。马轩，等(2003)、潘兆娥，等(2010)、李成奇，等(2011)、孙宁，等(2011)、匡猛，等(2011)、赵亮，等(2012)、冯艳芳，等(2015)利用SSR分子标记分别构建了“18个彩色棉品系、中棉所48、百棉系列棉花自交系品种(系)、2009年度黄河流域国家棉花区试57份参试品材料、2008年中国3大棉区8个棉花主产省份32份棉花主栽品种、12个不同来源系统的棉花品种、20份新疆棉花品种”的DNA指纹图谱以及进行遗传多样性分析。

本研究拟通过对新疆190份棉花材料进行遗传多样性评价，为育种家在种质资源创制、亲本有效选配和品种合理种植提供有效参考，使杂交亲本的选择更有针对性，减少配置杂交组合的盲目性，提高杂交后代育种选择效率，从而加快棉花新品种的选育。

1 材料与方法

1.1 材料

190份不同的棉花种质材料均来自于新疆的农家种，包括80份北疆主栽棉花品种和110份南疆主栽棉花品种；根据山东棉花中心前期研究的报道，选取26个棉花基因组SSR标记用于本次实验研究。SSR引物由北京擎科生物科技有限公司。

1.2 田间试验设计与性状调查

2021年，80份北疆主栽棉花品种种植于新疆昌吉州玛纳斯县六户地镇陈家渠村，膜幅宽2.05 m，一膜6行，行距为66 cm和10 cm模式，株距9.5 cm，密度为277020 株/公顷， 拖拉机将地膜滴灌带铺好，机械膜上打孔划区人工点播；110份南疆主栽棉花品种种植于库尔勒市阿瓦提农场4分场，密度为205125 株/公顷。田间大田管理方法均同常规大田；吐絮后，收花轧花考种，考种后每个材料称取20 g棉样，寄送农业部棉花品质监督测试中心(安阳)利用 HVI1000 测定，采用 HVICC 国际校准棉样，测定纤维上半部平均长度、整齐度指数、断裂比强度、马克隆值和伸长率5项纤维品质指标。

1.3 DNA提取和PCR扩增

在培养箱中种植供试材料，温度28℃，光照 16h/8h 黑暗，湿度60%。两叶一心期，每个供试材料随机选取三株，每株取幼嫩新鲜的叶片混合于2 ml的EP管内，加入700 uL提取液，并在每一管中加入一粒钢珠，用全自动样品快速研磨仪研磨180 s，最后利用改良的CTAB法提取棉花基因组DNA。DNA纯度和浓度使用多功能酶标仪(SparkTM 10M)检测。

PCR反应体系为10 μL：DNA模板2 μL，2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)5.0 ul，前后引物各0.5 μL，ddHO 2.0 μL。本实验使用的2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)购于南京诺唯赞生物技术公司，包含3G Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、可视化红色染料和优化的缓冲体系；PCR热循环程序：第一步，95℃预变性5 min，第二步，94℃变性30 s，第三步，55℃退火45 s，第四步，72℃延伸1 min，第二步到第四步30个循环，第五步，72℃延伸10 min，10℃保存。

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

PCR扩增产物的检测在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，具体操作步骤如下：把成套的两块干净的玻璃板对齐，平放，两边用夹子夹紧，至于平板上；用玻璃棒引流，缓慢倒入8%的聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)，插入梳子，放置15 min；待胶凝固后，松掉夹子，把有凝胶的玻璃板装入电泳槽中，倒入1×TBE电泳缓冲液，并用夹子两边加紧，继续加入电泳缓冲液，没过凝胶，拔梳子；点样(上样量为1 μL)，180 V恒压环境下电泳1.5 h。读带标准：对于同一引物在190个品种中扩增出的条带，带型占多数的带型记录为1，其余记录为2、3、4等。

1.5 数据统计

190份棉花材料农艺性状的最小值、最大值、平均数、标准差以及变异系数等描述性统计信息使用 Microsoft Excel 2016 进行分析，并使用 Shannon 多样性指数衡量研究上述材料的遗传多样性，公式为： H′ = -∑PLnP；采用POPGENE 32软件计算基于26对SSR分子标记的群体等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)和多样性指数(Shannon，H′)等。使用PowerMarker 3.25计算主要等位基因频率(Minor Allele frequencies, MAF)和多态性信息量(polymorphism information content，PIC)等，并根据Nei's分子遗传距离进行非加权组平均法(Unweighted Pair-group Method With Arithmetic Means, UPGMA)聚类分析，最终使用MEGA 5.2 软件绘制树形聚类图。

2 结果与分析

2.1 表型性状的遗传多样性分析

收集的新疆190份棉花资源在8个主要性状上呈现较大的变幅度范围(表1)，籽棉产量最大值为7674.00 kg/hm，最小值为1250.10 kg/hm，平均值为5589.61 kg/hm，变异幅度为6423.90 kg/hm；皮棉产量最大值为3551.25 kg/hm，最小值为390.00 kg/hm，平均值为2337.25 kg/hm，变异幅度为 3161.25 kg/hm；衣分最大值为54.93%，最小值为28.90%，平均值为41.15%，变异幅度为26.03%；纤维长度最大值为40.00 mm，最小值为26.90 mm，平均值为32.35 mm，变异幅度为13.10 mm；断裂比强度最大值为53.00 cN/tex，最小值为26.00 cN/tex，平均值为35.48 cN/tex，变异幅度为27.00 cN/tex；马克隆值最大值为 5.50，最小值为3.30，平均值为4.40，变异幅度为2.20；纤维整齐度最大值为89.30%，最小值为80.50%，平均值为85.12%，变异幅度为8.80%；纤维伸长率最大值为14.00%，最小值为2.80%，平均值为6.79%，变异幅度为11.20%。

新疆190份棉花资源在8个主要性状上呈现较为丰富的表型变异(表2)，变异系数(CV)范围为2.06%～25.62%，其中3个产量相关性状中，皮棉产量(25.62%)的变异系数最高，超过了20%，而籽棉产量和衣分的变异系数分别为18.73%和12.13%。与纤维品质相关的5个性状，变异系数变化范围较大，为2.06%～22.13%，其中断裂比强度的变异系数最大(22.13%)，依次为伸长率(16.70%)、上半部平均长度(11.52%)和马克隆值(10.88%)，而整齐度指数的变异系数最小(2.06%)。香农(Shannon)多样性指数范围为1.4771～2.0631，以纤维整齐度的最高，纤维断裂比强度的最低，7 个纤维性状指标的Shannon多样性指数均高于1.4000。

表1 新疆190份棉花材料主要性状的统计参数

表2 新疆190份棉花材料主要性状的多样性情况

2.2 SSR 核心引物扩增位点

利用26 对SSR 核心引物在新疆190份棉花材料中累计检测到179个等位基因位点，等位基因位点变幅度范围为3～14个，平均为6.88个(表3)；累计有效等位基因数(Ne)为96.5017，变幅范围为2.2284～6.0081，平均值为3.7116；主要等位基因频率(MAF)的变幅范围为0.2849～0.5632，平均值为0.4084；基因多样性指数变幅度范围为0.5512～0.8336，平均值为0.7150；多态性信息含量(PIC)值的变幅度范围为0.4525～0.8147，平均值为0.6714，Shannon 多样性指数(H′)变幅度范围为0.9221～2.0435，平均值为1.4562。

2.3 基于26个SSR标记的聚类分析

利用26个SSR分子标记信息对新疆190份棉花材料进行Nei's分子遗传距离计算，并构建复合的一致性系统进化树，将其分为8个类群，其中类群Ⅰ包含38份材料，类群Ⅱ包含19份材料，类群Ⅲ包含27份材料，类群Ⅳ包含21份材料，类群Ⅴ包含18份材料，类群Ⅵ包含31份材料，类群Ⅶ包含12份材料，Ⅷ包含24份材料(图1)。

表3 新疆190份棉花材料 26个SSR位点的遗传多样性信息

8个类群在3个产量性状(籽棉产量、皮棉产量和衣分)的平均值范围分别为3468.67～6261.15 kg/hm、1486.97～2803.6 kg/hm和32.43%～44.61%，其中类群Ⅰ在3个产量性状指标中最小，类群Ⅷ最大；纤维品质相关的5个性状指标中，纤维上半部平均长度和断裂比强度在8个类群的平均值范围分别为29.52～39.04 mm和29.45～50.22 cN/tex， 类群Ⅳ最小，类群Ⅰ最大，马克隆值的平均值范围为4.11～4.80，类群Ⅰ最小，类群Ⅳ最大，纤维整齐度指数和伸长率的平均值分别为84.16%～87.46%和6.12%～7.53%，类群Ⅴ最小，类群Ⅰ最大(图1，表4)。

表4 新疆190份棉花材料各类群主要性状的平均值统计

3 结论和讨论

遗传多样性分析是作物种质资源评价的重要方面，可以为育种家们在种质资源创新和亲本选配过程中提供有力参考，使杂交亲本的选择更有针对性，从而提高杂交后代育种选择效率。本研究对新疆190份棉花材料进行了表型性状的遗传多样性分析，8个主要性状呈现出较为丰富的表型变异，表型变异系数范围为2.06%～25.62%，香农(Shannon) 多样性指数范围为1.4771～2.0631， 其中7 个性状的香农(Shannon)多样性指数均高于1.4000。综上数据说明，190份棉花材料表现出了较高的遗传多样性，资源类型比较丰富，利于特异种质资源的筛选和核心种质的提取。

分子标记能够从DNA水平反映生物个体间基因组中的某些差异，且不受环境影响，被广泛应用于作物的遗传多样性分析和品种间的亲缘关系鉴定。本研究利用26对SSR核心引物对新疆收集的190份棉花材料进行遗传多样性分析，基因多样性指数变幅度范围为0.5512～0.8336，多态性信息含量(PIC)值的变幅度范围0.4525～0.8147，香农(Shannon)多样性指数(H′)变幅度范围为0.9221～2.0435，说明SSR标记的遗传信息比较丰富，190份棉花材料在DNA水平存在一定的遗传多样性。

基于26个SSR分子标记信息，本研究对新疆190份棉花材料进行了Nei's分子遗传距离计算，将其分为8个类群，除了类群Ⅰ与其他7个类群分子遗传距离较远外，其余7个类群分子遗传距离较小。8个类群在8个主要性状上呈现较为丰富的表型变异， 3个产量性状(籽棉产量、皮棉产量和衣分)的平均值范围分别为4468.67～6261.15 kg/hm、1486.97～2803.6 kg/hm和32.43%～44.61%，5个纤维品质性状(上半部平均长度、断裂比强度、马克隆值、纤维整齐度指数和伸长率)在8个类群的平均值范围分别为29.52～39.04 mm、29.45～50.22 cN/tex、4.11～4.80、84.16%～87.46%和6.12%～7.53%。 类群Ⅰ的纤维上半部平均长度、断裂比强度、整齐度指数和伸长率最优，而籽棉产量、皮棉产量和衣分较低；类群Ⅷ的籽棉产量、皮棉产量和衣分较高，而纤维上半部平均长度和断裂比强度最低。遗传相似系数聚类分析结果反映了新疆190份棉花材料之间的亲缘关系，今后应将更丰富的形态信息与分子数据结合在一起形成指纹图谱，使品种信息更加全面、准确，从而为后续棉花种质资源创新和新品种选育提供了科学依据。

图1 基于SSR标记数据的新疆190份棉花材料的遗传聚类图