植物甾醇、大豆异黄酮、杨梅素混合保健颗粒对围产期奶牛能量代谢病防控效果的评价

杨明茂，田 艳，高畅鸿，王 爽，麻芯茹，范文文，吕鑫泉，张冰冰，徐 闯，杨 威*

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

围产期是奶牛营养代谢病的高发时期，也是奶牛饲养管理中最具挑战性的时期之一。在产前21 d到产后21 d期间，奶牛先后经历妊娠-分娩-泌乳的生理变化，体内营养需求显著增加，然而由于干物质摄入量不足，无法满足自身营养需求，导致奶牛机体内能量代谢失衡，进而引发能量负平衡(negative energy balance,NEB)[1]。NEB是围产期奶牛普遍经历的亚健康状态，这个时期奶牛会进行体脂动员来满足泌乳前期所需的能量需求，然而严重的NEB所致过度的体脂动员产生大量非酯化脂肪酸(NEFA)进入肝脏，导致围产期奶牛肝脂代谢及胆固醇代谢紊乱[2-3]。同时，围产期奶牛因体内代谢失衡，导致活性氧(ROS)的增加，进而诱导脂质过氧化，引发线粒体损伤和细胞凋亡，进一步损伤肝脏功能[4]，导致能量代谢失衡类疾病(酮病和脂肪肝)的发生，对奶牛的泌乳量、繁殖性能、经济效益等多方面产生负面影响[5]。因此，研发有效的防控药物对奶牛业健康持续发展尤为重要。

随着禁抗令的实行，植物源性功能饲料添加剂的研发及应用逐渐受到畜禽养殖业的重视。黄酮类化合物及类固醇化合物在反刍动物营养学领域具有重要的应用价值，与反刍动物的能量代谢、内分泌及预防肝损伤有着密切的关系，具有抗氧化、抗炎和保护肝脏损伤等药理活性[6-7]。杨梅素和大豆异黄酮作为黄酮类化合物，通过对生物膜有直接的保护作用，增强肝脏的抗损伤能力，有利于缓解泌乳初期的肝脂代谢紊乱，而且黄酮类化合物副作用小、安全无污染且来源广泛[8]，作为新型饲料添加剂具有巨大的市场潜力。植物甾醇是植物来源的天然类固醇化合物，具有改善肝脏胆固醇代谢，调节生长等作用[9]。因此，本试验拟采用植物甾醇、大豆异黄酮和杨梅素为主要原料制备产后保健颗粒，通过测定奶牛产后能量代谢病的发病率、血液生化指标、乳品质、尿成分指标和氧化应激指标的变化，旨在评价保健颗粒对缓解奶牛产后能量代谢失衡的影响特征，为规模化牧场产后保健提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂棕榈油购自益海粮油工业有限公司;植物甾醇、大豆异黄酮、杨梅素、玉米油、大豆卵磷脂、胆碱、维生素E、硬脂酸镁购自浙江一诺生物科技有限公司;医用胃溶型聚丙烯酸树脂4号购自西安天正药用辅料有限公司。

1.2 保健颗粒的制备按比例取一定量的棕榈油(70%)、玉米油(7%)、硬脂酸镁(0.5%)和医用胃溶型聚丙烯酸树脂4号(0.5%)混合后在80℃下溶解，随即将植物甾醇(5%)、大豆异黄酮(5%)、杨梅素(5%)、大豆卵磷脂(3%)、胆碱(2%)、维生素E(1%)称量混合后迅速放入，迅速搅拌混合1 min，将其倒出并快速预冷，制成直径0.2～0.4 cm的颗粒。称取后于20 g/袋装入食品级别的封口袋中，密封干燥环境下保存。

1.3 试验动物与分组本试验于黑龙江省某集约化奶牛养殖场进行。采用随机分组试验设计，随机选取2～3胎次、体况相近的围产期奶牛18头，对照组和试验组各9头，其中对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮的同时添加制备的保健颗粒(每头牛40 g/d)并充分混匀，于奶牛分娩当天连续饲喂7 d，采集每头试验奶牛的血液、乳汁和尿液样品。

1.4 样本采集与检测

1.4.1血液样本 试验奶牛于产前21，14，7 d及产后0，3，7，14，21 d尾根静脉采集血样15 mL，待血液样本凝固分层后，4 000 r/min离心10 min，吸取上清至离心管中，每管500 μL分装，-80℃冻存备用。使用全自动血液生化分析仪(Beckman DXC800)检测血清中谷草转氨酶(AST)、谷草/谷丙(AST/ALT)、总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、葡萄糖(GLU)、β-羟丁酸(BHBA)、非酯化脂肪酸(NEFA)、钙(Ca)的含量。氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)均按照生化试剂盒(北京索莱宝)说明进行检测。

1.4.2乳汁的采集与检测 记录试验奶牛的日产奶量，采集乳汁时，用温水擦洗乳房并消毒，人工挤乳弃去前2～3把乳汁，收集乳汁20 mL，加入防腐剂，-20℃冻存待检。采用乳成分分析仪(CombiFoss 4000)检测乳汁中乳脂率(milk fat)、乳蛋白率(milk protein)、乳糖率(lactose)、体细胞数(SCC)和非脂乳固体(SNF)指标的含量。

1.4.3尿液的采集与检测 于清晨榨乳前，采用阴道按摩法收集试验泌乳奶牛中段尿液20 mL，置于-20℃冰箱冷冻保存。使用尿液分析仪(桂林优利特 URIT-500B)检测白细胞(WBC)、酮体(KET)、葡萄糖(GLU)、尿比重(SG)、酸碱度(pH)、维生素C(Vc)、尿钙(Ca)、肌酐(CR)的含量。

1.5 检测结果判定依据当奶牛血清BHBA浓度≥1.2 mmol/L时，认定为酮症。奶牛脂肪肝判定依据按照血清GLU、AST和NEFA的含量,采用公式Y=-0.510-0.003NEFA+2.840GLU-0.053 AST计算Y值，判定脂肪浸润程度，当Y<1时，则奶牛判定为脂肪肝，反之则为健康奶牛[10]。

2 结果

2.1 保健颗粒对奶牛能量代谢病发病率的影响根据检测结果判定，随机选取的18头奶牛中，对照组奶牛酮病的发病率为44%，脂肪肝的患病率为33%。饲喂产后保健颗粒组奶牛酮病和脂肪肝的发病率为11%。

表1 围产期奶牛能量代谢病的发病率

2.2 保健颗粒对围产期奶牛血液相关生化指标的影响

2.2.1肝功能指标 与对照组相比，试验组AST和AST/ALT均在产后3，21 d显著性降低(P<0.05)；GGT和LDH含量均在产后14，21 d显著降低(P<0.05)；TBIL在产后7，14，21 d显著低于对照组；GLO在产后7，14 d显著降低；A/G在产后7，14 d显著升高，产后21极显著高于对照组(P<0.01)；试验组ALB水平在产后高于对照组，但无显著差异(P>0.05)(图1)。

与对照组相比，*示差异显著(P<0.05)；**示差异极显著(P <0.01)。下同

2.2.2能量代谢相关指标 试验组NEFA水平在产后3,21 d显著低于对照组(P<0.05)，在产后7,14 d极显著降低(P<0.01)；BHBA水平在产后7,14,21d均显著降低且趋势平稳(P<0.05)；试验组GLU在产后3 d显著升高，在产后7,14 d极显著高于对照组(P<0.01)；试验组Ca水平在产后均高于对照组，且其含量大于2.0 mmol/L(图2)。

图2 保健颗粒对奶牛能量代谢指标NEFA、BHBA、GLU和Ca的影响

2.3 保健颗粒对奶牛乳汁成分的影响与对照组相比，试验组的日产奶量在产后0～9 d较低，而在产后10～21 d的产奶量均高于对照组，但试验期间产奶量差异不显著；试验组乳脂率均低于对照组，产后21d显著降低(P<0.05)；Lactose含量在产后21，32 d显著高于对照组(P<0.05)；其余指标均无显著性差异(图3)。

图3 保健颗粒对产奶量和乳品质的影响

2.4 保健颗粒对围产期奶牛尿成分的影响试验组KET水平在产后7，14，21 d均显著降低(P<0.05)；试验组WBC、VC水平在产后3，7 d显著降低且处于正常水平；pH水平在产后14 d显著高于对照组(P<0.05)；其他指标SG、CR、Ca和GLU均无显著性差异(P>0.05)(图4)。

图4 保健颗粒对尿常规指标的影响结果

2.5 保健颗粒对围产期奶牛氧化应激的影响试验组MDA在产后3，21 d显著低于对照组，产后7，14 d发生极显著降低(P<0.01)；试验组SOD水平在产后3，7，14，21 d均显著高于对照组(P<0.05)；试验组GSH水平在产后均高于对照组，产后14 d具有显著差异(P<0.05)(图5)。

图5 氧化应激指标检测结果

3 讨论

3.1 保健颗粒的制备随着我国奶牛养殖业的快速发展，奶牛单产不断推高，而由于饲养管理技术及营养调控技术相对不足，使得围产期奶牛营养代谢病高发群发，已成为制约我国奶牛业高效发展的主要关键问题。因此，筛选研发绿色高效的围产期奶牛营养调控产品对降低疾病发生，提高围产期奶牛生产性能尤为重要。植物提取物因富含多种生物活性成分且具备天然绿色、无耐药性、无药物残留等特点成为最具前景的畜禽饲料调节剂产品。大豆异黄酮是一种存在于豆科植物中的黄酮类化合物，可降低肝损伤造成的过氧化脂质，减缓肝细胞谷胱甘肽的消耗，进而缓解脂质代谢紊乱，明显降低肝脏脂肪蓄积，减轻肝组织脂肪变性[11]。杨梅素作为一种天然黄酮类化合物，具抗氧化、降低转氨酶活力和炎症反应，保护肝脏损伤等多种作用[12]。植物甾醇是一种类固醇化合物，不但可作为肝功能改善剂，还可作为肝功能障碍的预防剂。在其他选取原料中，棕榈油和玉米油作为过瘤胃保护剂，可增加反刍动物的能量及蛋白质含量，补充泌乳初期的营养需求。大豆卵磷脂、维生素E和胆碱作为辅助功能成分，在代谢过程中可产生部分必须脂肪酸，为机体提供营养物质，同时有助于对油脂和脂溶性维生素的消化吸收，也有利于缓解机体的亚健康状态；硬脂酸镁和医用胃溶型聚丙烯酸树脂4号有利于制粒，可在体内起到润滑的作用，加快肠胃的蠕动功能，提高奶牛的食欲。因此，本试验选取以植物甾醇、大豆异黄酮和杨梅素为主要原料制备产后保健颗粒，旨在评价对缓解奶牛产后能量代谢失衡的影响特征。

3.2 保健颗粒对奶牛血液生化指标和发病率的影响以围产期能量代谢失衡为病理学基础的酮病、脂肪肝是奶牛重要的常见多发病，且多发于高产奶牛，肝脏作为高产奶牛在产后最易受到能量代谢失衡和生理应激影响的器官，其受损情况可由血清中多种生化指标AST、AST/ALT、GGT、LDH和TBIL反映。当肝细胞受损时，ALT和AST就会大量释放到血清中，因此两者比值AST/ALT可直接反映肝脏损伤程度[13]。TBIL是反映肝脏排泄分泌和解毒功能有无损害的指标，当肝功能受损时，血清TBIL、GGT和LDH含量会有不同程度的升高。本试验中，与正常饲喂组相比，饲喂保健颗粒组血清AST、AST/ALT、GGT、LDH和TBIL等各项指标含量均在产后显著降低。另外，GLO、ALB和A/G也是肝功能检查中的重要参考指标，ALB由肝脏合成，一般情况下ALB越多，表明机体越健康，GLO主要由浆细胞分泌产生，作为抗体蛋白在免疫过程发挥重要功能。本试验中，试验组饲喂3 d后，ALB和A/G水平高于对照组，GLO含量显著降低，说明本试验制备的保健颗粒可缓解肝功能损伤，增强泌乳初期奶牛的免疫力和抵抗力。同时，有研究表明血清AST、NEFA和GLU 3项指标可全面评价奶牛围产后期脂肪肝的发病情况[14]。本试验结果显示，试验组AST和NEFA水平在产后3～21 d均显著低于对照组；而GLU水平在产后3～14 d显著升高，表明饲喂保健颗粒可改善肝功能损伤，为机体提供能量，降低了体脂的降解，增强了奶牛的免疫力，最终减少奶牛体内酮体和脂类物质的蓄积，可有效的缓解能量代谢病的发生。

3.3 保健颗粒对奶牛产奶量和乳品质的影响产奶量和乳品质是一个比较直观体现奶牛健康和代谢平衡的指标。酮病和脂肪肝不仅会造成奶牛产奶量、乳品质和繁殖率的降低，还会增加其他疾病的发病率。MCART等[15]报道，与健康奶牛相比，酮病奶牛日产奶量会减少1.4～1.9 kg/d，并显著升高乳脂率，降低乳蛋白含量。在本试验中，饲喂保健颗粒组奶牛日产奶量在产后0～9 d略低于对照组，而在产后10～21 d的产奶量均有所升高；其乳成分中的乳脂率也低于对照组；试验组乳糖水平显著升高，但乳蛋白含量差异不显著。郝振荣等[16]研究发现，在奶牛日粮中添加适量的大豆黄酮，可缓解奶牛酮病和脂类代谢疾病，显著提高日产奶量及乳蛋白的含量。朱河水等[17]也研究发现，大豆异黄酮在一定程度上不但能提高泌乳量，还能提高泌乳后期的产奶量。同时，植物甾醇可改善肝功能损伤，促进产奶量的提高和体细胞减少[18]。这与本研究中饲喂产后保健颗粒可提高奶牛的日产奶量，增加乳糖含量，降低乳脂率，提高乳品质的结果相符。

3.4 保健颗粒对奶牛尿液成分的影响尿液是研究疾病标志物的理想来源，相比血液，它具有易获取、无创伤的特点，检测尿成分指标可评估机体酸碱平衡和健康状况。尿液pH值是衡量酸碱平衡的一项重要指标，白云龙[19]发现，健康奶牛尿液pH值常处于7.7～8.7之间。尿液中WBC和VC可反映泌尿系统是否感染，本试验2组奶牛分娩0，3 d均检测到了该指标的升高，可能与分娩有关。奶牛酮病的主要症状是低血糖和高酮(乳酮、尿酮和血酮)，其中尿液KET也是诊断奶牛酮病的一项标准。在本试验中，试验组奶牛KET水平在产后7，14，21 d显著低于对照组，pH值在产后14 d显著升高。据此，综合评价产后奶牛尿液KET和pH值有利于酮病的临床快速诊断。

3.5 保健颗粒对奶牛氧化应激指标的影响植物甾醇作为类固醇化合物，不但可以降低血液中的胆固醇水平，还可用作动植物的抗氧化剂。据报道适量的植物甾醇可有效提高奶牛的产奶量，显著降低肝脏脂质过氧化产物，并提高某些氧化酶活性，达到抗氧化效果，保护泌乳初期肝脏损伤[20]。杨丽[21]发现，在断奶仔猪日粮中添加30 mg/kg的植物甾醇，MDA水平降低11.58%，并不同程度地提高了SOD和GSH-Px的含量。黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性，如清除超氧阴离子和过氧自由基，同时能显著提高SOD和GSH等抗氧化酶的活性。王新军等[22]也发现，葛根总黄酮能提高肝脏抗氧化酶活性，促进自由基的消除，具有抗氧化和保护肝损伤的作用。这与本研究结果相一致，饲喂保健颗粒后可显著降低奶牛体内MDA的含量，同时显著提高了SOD和GSH等抗氧化酶的活性，在一定程度上缓解了奶牛泌乳初期氧化应激所致的肝损伤。

综上所述，奶牛产后饲喂以植物甾醇、大豆异黄酮和杨梅素为主要原料制备的产后保健颗粒可以显著缓解肝损伤，提高抗氧化能力、免疫性能和泌乳性能，最终降低奶牛能量代谢病的发病率，为规模化牧场奶牛产后保健措施提供了理论依据。