秦皇岛地区蛋鸡致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因及耐药性检测分析

张海龙，刘优优，何云凤，党儒尧，陈 玥，刘梦雪，李佩国，李蕴玉

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604)

鸡大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)病是养鸡场最常见的细菌病之一，具有较高的发病率和病死率[1]。发病鸡和带菌鸡是鸡大肠杆菌病的主要传染源，E.coli可通过呼吸道、消化道、空气等多种途径传播[2-3]，不同日龄的鸡均可感染发病，常与呼吸道疾病混合感染，使蛋鸡养殖企业的经济效益降低。E.coli血清型众多，抗原结构复杂，并且具有一定的区域性，不同血清型的菌株缺乏交叉免疫。致病性的强弱不仅与血清型有关，还与自身携带的毒力有关，致病性E.coli基因组可编码黏附素、摄铁系统等多种毒力因子，这些毒力因子入侵宿主体内，使机体各组织器官受损严重[4]。目前，对于E.coli病的防治主要依赖抗生素，但耐药性的增加，药物残留等问题，引起人们对食品安全的担忧。本试验对2021年从河北省秦皇岛地区分离的36株致病性E.coli进行血清型、毒力基因及耐药性检测，为该地区E.coli病的用药提供临床指导和理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源2021年从河北秦皇岛地区不同养鸡场分离鉴定的36株致病性E.coli，由河北省预防兽医学重点实验室保存。E.coli质控菌株ATCC 25922由河北省预防兽医学重点实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器普通营养琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；DL2000 DNA Marker、2×Taq Marker Mix 购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；E.coli血清型鉴定用O型血清因子购自天津生物芯片技术有限公司；17种药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；PCR仪(C1000 TOUCH) 购自德国Analytikjena公司；台式离心机(TDL-40B)购自BIOBASE公司。

1.3 分离菌株的血清型检测参考文献[5]的方法，采用大肠杆菌O型血清因子进行玻片凝集试验，检测分离的36株致病性E.coli的血清型。

1.4 分离菌株的毒力基因检测按照DNA提取试剂盒进行DNA的提取，根据文献[6-7]由北京生物工程有限公司合成毒力基因Vat、astA、hlyF、colv、Ler、eaeA、fimC、tsh、ompT、Iss、iroN、iucD、iutA、iutB、irp2、fyuA等16对引物(引物序列见表1)。以提取的DNA为模板，采用 PCR方法进行毒力基因的检测。PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52～66℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR反应体系：2×Taq Master mix 10 μL,上、下游引物各1 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6 μL，总体积为20 μL。对胶回收分离菌株的PCR扩增产物进行测序，分离菌株的测序结果与GenBank数据库中参考株的基因序列进行同源性分析。

1.5 药物敏感性试验对分离的36株致病性E.coli采用CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)推荐的K-B药敏纸片法进行试验，抗生素分别为β-内酰胺类(氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松)，四环素类(土霉素、多西环素)，喹诺酮类(诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星)，氨基糖苷类(卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星)，大环内酯类(替米考星)，磺胺类(磺胺间甲氧嘧啶、复方新诺明、磺胺二甲氧嘧啶)，酰胺醇类(氟苯尼考)，林可胺类(林可霉素)。以E.coliATCC25922为质控菌株，以敏感(sensitivity,S)、中介(intermediate,I)、耐药(resistance,R)3种形式判定药敏试验结果。

1.6 耐药基因的检测按照DNA提取试剂盒进行细菌DNA的提取，参考文献[8-9]由北京生工合成25种E.coli的耐药基因引物(引物序列见表2)，包括β-内酰胺类(CMY-2、KPC、Oxa-1、Oxa-5、SHV)、四环素类(Tet(C)、Tet(E)、Tet(G))、喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、gyrA)、氨基糖苷类(aadA1、aadA2、StrA、StrB、aadD)、大环内酯类(ermB、ermA、mefA)、磺胺类(dhpS、Sul-1、Sul-2、Sul-3)。以提取的DNA为模板，采用 PCR方法进行耐药基因的检测，PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 40 s，52～58℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR反应体系：2×Taq Master mix 10 μL,上、下游引物各1 μL，DNA模板 3 μL，ddH2O 5 μL，总体积为20 μL。

表1 毒力基因引物序列

表2 耐药基因引物序列

续表2

2 结果

2.1 分离菌株血清型检测结果用E.coli标准O型血清因子进行玻片凝集试验检测分离菌株的血清型，结果显示36株致病性E.coli共有10种不同的血清型，34株定型，2株未定型。以O78、O2、O1为主要流行的血清型，分别占比25.00%，19.44%，16.67%；而O9、O18和O147检出的菌株数均为1株，各占比2.78%(表3)。

表3 36株鸡源致病性E.coli血清型检测结果

2.2 分离菌株毒力基因检测结果通过PCR方法检测16种毒力基因的携带情况，结果显示，36株致病性E.coli携带14种不同毒力基因，未检测到Ler、eaeA2种毒力基因(图1)。

M.DL2000 DNA Marker;1～14泳道.fimC、tsh、iroN、iucD、iutA、iutB、irp2、fyuA、ompT、Iss、vat、astA、hlyF和colv;15.空白对照

36株致病性E.coli中，iutB毒力基因检出率最高，为88.89%(32/36)；其次为tsh、fimC和hlyF毒力基因检出率也较高，分别为80.56%,72.22%,72.22%；ompT、iroN、irp2、iucD、Iss和astA的检出率在36.11%～66.67%之间；而Vat、colv毒力基因检出率较低，分别为11.11%和16.67%(表4)。

表4 36株鸡源致病性E.coli毒力基因检测结果

2.3 分离菌株药物敏感性试验结果由表5可知，36株致病性E.coli对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶的耐药率较高，均在86.11%以上；对复方新诺明、氟苯尼考、头孢曲松、替米考星的耐药率在77.78%～83.33%之间，对多西环素、土霉素、氨苄西林、诺氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星的耐药率在38.89%～69.44%之间；而林可霉素、卡那霉素、阿米卡星的耐药率较低，均在27.78%以下。

表5 36株鸡源致病性E.coli耐药性检测结果

2.4 分离菌株多重耐药结果由图2可知，2021年分离的36株菌最少耐4种药物，有2株，占比5.56%；最多耐16种药物，有4株，占比11.11%；对11种药物耐药的菌株数最多，有8株，占比22.22%；对5，7，8，15种药物耐药的菌株数均为1株，各占比2.78%。

图2 36株致病性E.coli对17种抗菌药物的多重耐药情况

2.5 分离菌株耐药基因检测结果分离的36株致病性E.coli以Sul-1、dhpS、qnrD和Sul-2耐药基因为主，检出率在83.33%以上，Sul-3、gyrA、mefA、qnrC、Tet(G)和ermB耐药基因的检出率为61.11%～77.78%，SHV、Oxa-5、aadA1和CTX-2耐药基因的检出率较低，分别为25.00%,22.22%,8.33%,2.78%，而KPC、qnrA和qnrB基因均未检出(表6)。

表6 36株鸡源致病性E.coli耐药基因检测结果

3 讨论

3.1 秦皇岛地区鸡源致病性E.coli的血清型分析E.coli的血清型不同，其致病力强弱也有所不同。周明夏等[10]对江苏省部分地区的159株鸡源E.coli进行血清型鉴定，结果显示除41株未定型外，剩下的118株以O24、O78、O88和O65为优势血清型，分别占比10.06%,2.52%,2.52%,2.52%。张召兴等[11]对邢台地区的32株致病性E.coli进行血清型鉴定，结果显示32株E.coli有5株未定型，其余的27株共属于 11 个血清型， O78、O148、O2和O8为主要流行血清型，分别占比 18.9%,15.6%,12.5%,12.5%。本试验通过对秦皇岛地区的36株致病性E.coli进行血清型鉴定，发现36株E.coli中有2株未定型，34株定型的E.coli以O78、O2和O1为主要流行的血清型，分别占比25.00%，19.44%,16.67%。由此表明，致病性E.coli的流行血清型与地区存在紧密的联系,地区不同所流行的血清型也有所差异。

3.2 秦皇岛地区鸡源致病性E.coli的毒力基因分析禽致病性E.coli入侵机体后，不同的毒力因子之间互相组合，共同发生作用，从而导致鸡发病。不同的毒力因子所导致的致病性强弱也有所差异。张子越等[12]对山东部分地区的20株E.coli进行10种毒力基因的检测，结果表明13株含有 5种以上毒力基因，占总菌株的65%；4株同时含有7种毒力基因，占总菌株数的20%；仅有1株未检测到毒力基因。高玉斌等[13]对山东、西藏等7个省区的130株E.coli进行7种毒力基因检测，iroN毒力基因的检出率最高，为69．23%(90 /130)；stx2检出率最低，为1.54%(2 /130)；ompT、iss、fimC、hlyF、iutA的检出率为50%～60%。本试验结果表明，36株致病性E.coli中iutB毒力基因检出率最高，为88.89%(32/36)；ompT、iroN、irp2、iucD、Iss、astA的检出率在36.11%～66.67%之间；而Vat、colv毒力基因检出率较低，分别为11.11%和16.67%。由此表明，不同地区鸡源致病性E.coli的毒力基因流行趋势存在一定的差异。

3.3 秦皇岛地区鸡源致病性E.coli的耐药性检测分析E.coli病在防治过程中耐药菌株的增多，多重耐药现象不断呈上升趋势，导致E.coli病的防治更加困难，使各国对E.coli病的防治都面临着巨大的困难和挑战。SOLA-GINES等[14]对西班牙分离到的22株APEC进行耐药性检测，结果发现22株APEC对环丙沙星、四环素等4种抗生素的耐药率为78%～91%；对链霉素、磺胺甲恶唑等3种药物的耐药率为59%～69%；而对卡那霉素、庆大霉素等5种药物的耐药率较低，为6%～19%。王豪举[15]研究结果表明，开州地区117株鸡源E.coli对阿莫西林、氨苄西林、强力霉素的耐药率为85.8%～97.6%；而对阿米卡星、诺氟沙星、头孢他啶、头孢噻肟、安普霉素的耐药率低于 30%，具有很好的防治效果。本试验对秦皇岛地区的36株鸡源E.coli进行耐药性检测，结果表明分离的菌株对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶的耐药率较高，均在86.11%以上；对多西环素、土霉素、氨苄西林等7种抗生素的耐药率为38.89%～69.44%；而对林可霉素、卡那霉素、阿米卡星的耐药率较低，均在27.78%以下。

综上所述，本试验对该地区鸡源致病性E.coli的血清型、毒力基因和耐药性的流行趋势进行研究，为该地区大肠杆菌病的防治提供了用药指导和数据支持。