2005～2011年厦门市食物中毒副溶血性弧菌的病原特征分析

翁琴云++++++张建梅++++++朱滏++++++游小伟++++++陈泽辉++++++黄建炜

[摘要] 目的 分析2005～2011年25起食物中毒标本中分离的108株副溶血性弧菌的血清型分布、tdh基因携带情况和PFGE分型特征。 方法 血清学实验检测菌株的血清型别；实时荧光PCR法检测耐热直接溶血素（tdh）基因；脉冲场凝胶电泳（PFGE）和 BioNumerics软件对菌株进行分子分型分析。 结果 108株菌分为7个血清群、15个血清型，主要血清型是O3∶K6；所有菌株分成65个PFGE types（PT），相似度为34.1%～100.0%；92株菌携带tdh基因，阳性率为85.2%。 结论 引起厦门市食物中毒的副溶血性弧菌血清型分布呈多样性，优势血清型为O3∶K6，且大部分菌株具有tdh基因；同一克隆的菌株血清型可相同也可不同。

[关键词] 食物中毒；副溶血性弧菌；血清型；tdh；PCR；PFGE

[中图分类号] R155.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（a）-0004-05

副溶血性弧菌是引起食源性疾病的重要海洋微生物，是沿海城市食物中毒最常见的致病菌之一[1-4]。随着交通运输工具的发展，内地城市也出现了副溶血性弧菌引起的食物中毒事件[5]。

美国CDC通过食源性疾病主动监测网络也发现副溶血性弧菌引起的食物中毒有逐渐上升的趋势[6]。厦门是一个港口城市，微生物引起的食物中毒事件绝大多数都是由副溶血性弧菌导致的，从2005年到现在，已经从食物中毒样本中分离鉴定并保存了100多株副溶血性弧菌。本研究分析这些菌株的血清型别、主要毒力基因以及PFGE分型数据，以了解多年来本地区中毒菌株的病原菌分子流行病学特征，便于与各地优势流行菌型的比较和揭示其流行与发展趋势的规律。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 副溶血性弧菌来自2005～2011年厦门市25起食物中毒分离的菌株，其中来源于患者的粪便或肛拭子的菌株有99株，来源于食品清洗加工材料（菜刀、抹布、砧板）拭子的菌株有4株，来源于可疑食品的有5株。标准菌株购自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC 21617），沙门菌H9812为中国CDC提供。

1.1.2 主要的试剂与培养基 CHROMagarTM弧菌显色培养基，营养琼脂（北京陆桥），副溶血性弧菌诊断血清（Tianjin Biochip Co.），蛋白酶K（Amresco，美国）、内切酶SfiⅠ和XbaⅠ（NEB，美国），Seakem Gold Agar（Lonza，美国），DNA染色剂GelRed（Biotium，美国）；副溶血性弧菌荧光PCR检测试剂盒（Zeesan，厦门）。

1.1.3 仪器 荧光PCR仪CFX-96、脉冲凝胶电泳仪CHEFmapper和凝胶成像系统GelDocXR+（Bio-Rad，美国）。

1.2 方法

1.2.1 血清分型 按照副溶血性弧菌诊断血清使用说明书要求，对菌株的营养琼脂培养物以玻片凝集试验确定O抗原、K抗原型别，K抗原不凝集者定为K无法分型，用KUT表示。

1.2.2 toxR和tdh基因的检测 菌株DNA的提取及反应体系的配置按照副溶血性弧菌荧光PCR检测试剂盒说明进行，PCR反应条件：94℃ 3 min预变性后，94℃ 15 s，55℃ 40 s，72℃ 15 s，扩增45个循环；同时检测toxR和tdh基因。

1.2.3 PFGE分型 按照PulseNet China的标准方法进行操作。简要程序如下：制备4.2 MCF（麦氏度）的菌悬液，包埋制成胶块裂解、SfiI酶切，上样电泳后GelRed染色，拍摄图像。电泳参数：低分子量设为78 kb，高分子量设为396 kb，电泳时间为19 h，脉冲时间为10～35.03 s，电泳缓冲液加入终浓度为3.8 μg/L的硫脲。菌株的PFGE图像以BioNumerics 6.6进行聚类分析（UPGMA），用Dice 系数来评估PFGE 结果。分子量参考菌株为沙门菌H9812。

2 结果

2.1 血清学分型结果

从25起食物中毒事件标本分离108株副溶血弧菌，抗原分型结果见表1，O抗原包括O1、O2、O3、O4、O5、O8和O10等7个型别，其中O3群54株、O1群26株、O4群19株；K抗原可以分为13个型别，K6是优势型别（51株）； O3∶K6血清型是优势血清型（51株）。

分析25起食物中毒的病原菌血清型别，13起由单一的血清型引起，其余均为混合感染；由O3∶K6血清型或与其他血清型混合感染导致的共16起，由O4∶K8或与其他血清型混合感染导致的共5起。O1∶K25血清型仅在2005年出现过，在随后6年的食物中毒中均没有检出（表2）。

2.2 毒力基因检测结果

检测108株菌的toxR都为阳性，从种特异性基因确认为副溶血性弧菌，其中92株tdh+和16株tdh-，85.2%的菌株为产毒菌株；来源于患者的99株菌中有89株携带tdh基因，阳性率为89.9%，另外从来源于菜刀、抹布及一份食物中分离的3株菌也检测到tdh基因（表2）。

2.3 PFGE分型结果

将108株菌被限制性内切酶SfiI切出65个PFGE types（PT），酶切条带数为14～20。用BioNumerics6.6软件对酶切图谱进行聚类分析，各带型相似系数为34.1%～100.0%。主要为A、B、C 3个群， B群为优势型别，包括69株菌（63.89%），其带型相似度为78.3%～100.0%，B群又包含两个亚群，其相似率达87.2%（图1），对应的血清型主要是O3∶K6、O4∶K68和O1∶K25。

分别对O1、O3和O4群的菌株（26、54、19 株）聚类分析发现，血清型别相同的菌株PFGE带型相似度高，不同血清型菌株间差异较大（图2），血清分型与PFGE分型的结果有较好的相关性；O3群菌株主要的血清型是O3∶K6，2009年之前和之后分离的菌株可定义为两个PT亚群，其相似度为87.5%，有4～6个条带差异，差异主要集中在大小为244.4～336.5 kb的条带。

3 讨论

2005～2011年厦门地区食物中毒副溶血性弧菌的主要流行菌型为O3∶K6、O4∶K8，这7年25起食物中毒事件的标本中分别有 16 和 5 起分离到菌株，而且几乎每年都有，这与国内黄彦等[7]的报道类似。部分菌株（KUT）K抗原未能分型，可能是菌株在保存尤其是常温保存的过程中抗原表达或基因位点发生变异，或者现有分型血清种类的局限，例如第 20 起（2010年8月）食物中毒事件额标本分离到 7株菌，有两株为KUT，但在随后PFGE分型中带型高度一致，达97.3%，与其余5株菌最多仅有3个条带的差异，可能是在K抗原编码基因内发生了个别酶切位点的变异，但根据 Tenover等[8]的判断原则，这些菌株属于相同的克隆群。

副溶血性弧菌的毒力基因虽然不仅包括tdh，还包括trh、毒力岛等，但其tdh编码的耐热直接溶血素是与致病力最为密切的相关致病因子，而在本实验中89.9%的患者菌株都携带tdh基因，也恰好印证了这一观点。虽然Ottaviani等[9]报道了不带毒力基因的副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，但是在国内大部分的暴发事件分离到的菌株中毒力基因的携带率达到了85%以上[9]，所以在食物中毒事件暴发时，除了对样品进行病原菌检测外，检测tdh等毒力基因有利于分析和确认中毒事件的病原。

在25起食物中毒中，单一血清型感染和混合血清型感染各占一半左右，这种多血清型混合感染的食物中毒事件也常有报道[10-14]，然而同一起食物中毒中分离到的菌株有可能是患者自身携带的，也有可能是食品标本中存在的非致病菌，要验证其是否与暴发相关则需要采用其他方法进一步分析。本文以PFGE同源性分析，B群为PFGE分型的优势型别，O3∶K6血清型占大部分，O4∶K68、O1∶K25及部分 O4∶K8、O1∶KUT菌株也同属于这个群，且菌株间相似度较高，这表明这些菌株有着较高的同源性，极有可能是来自于同一个菌株克隆，即 O3∶K6克隆群，而国外也报道了自1995年分离到O3∶K6株已经形成了包括O3∶K6及其衍生血清型的O3∶K6克隆群，其中就涵盖了上述血清型[15]。在第4起和第11起食物中毒中，厨具或食品分离株与患者分离株有着相似度达97.3%的带型；而同时检出多种血清型的其他事件中，非临床标本来源的菌株与患者分离株带型相似度较低，说明中毒事件可能仅与其中的一个血清型相关，而其他血清型（特别是tdh-）菌株可能不是致病原因。

此外，单独对O3群菌株进行聚类分析可以得到相似度较高但年代分布不同的两个群，说明厦门这几年来引起食物中毒的主要菌株一直是源于本地，只是该型菌2009年后发生了2～3个酶切位点变异。

[参考文献]

[1] 罗贤如，黄薇，张锦周，等.深圳市2006～2010 年食物中毒情况分析[J].现代预防医学，2013，40（12）：2231-2233.

[2] 李孝权，李钏华，邓志爱，等.广州地区七年细菌性食物中毒的病原特征研究[J].中国卫生检验杂志，2011，21（3）：622-624.

[3] 黄芳，许少洪，李映霞，等.2009-2012年海珠区副溶血性弧菌食物中毒特征分析[J].中国公共卫生管理，2013， 29（5）：604-605.

[4] 刘秀梅.食源性疾病监控技术的研究[J].中国食品卫生杂志，2004，16（1）：3-9.

[5] 孙吉昌，游兴勇，刘成伟，等.一起由副溶血性弧菌致群体性食物中毒的调查报告[J].中国食品卫生杂志，2012， 24（1）：89-91.

[6] Centers for Disease Control and Prevention （CDC）.Vital signs：incidence and trends of infection with pathogens transmitted commonly through food-foodborne diseases active surveillance network，10 U.S. sites，1996-2010[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2011，60（22）：749-755.

[7] 黄彦，唐振柱，李秀桂，等.我国食物中毒副溶血性弧菌流行株血清型及分子分型现况[J].职业与健康，2013，29（8）：998-1000.

[8] Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis： criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol，1995，33（9）：2233-2239.

[9] Ottaviani D，Leoni F，Serra R，et al.Nontoxigenic Vibrio parahaemolyticus strains causing acute gastroenteritis[J].J Clin Microbiol，2012，50（12）：4141-4143.

[10] 方伟.2004～2007年广东省副溶血弧菌血清分型、分子特征及溯源研究[D].广州：暨南大学，2009.

[11] 李婧.我国部分地区不同来源副溶血弧菌的分子分型及遗传变异研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2012.

[12] 孙永祥，丁水军，罗芸.PFGE法分析多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒[J].中国卫生检验杂志，2011，21（10）：2444-2445.

[13] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（4）：776-780.

[14] 帅慧群，张睿，詹丽.多血清型副溶血性弧菌引起食物中毒的毒力基因检测和分子分型[J].中国卫生检验杂志，2013，23（18）：3524-3529.

[15] Nair GB，Ramamurthy T，Bhattacharya SK，et al.Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3∶K6 and its serovariants[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：39-48.

（收稿日期：2014-05-05 本文编辑：许俊琴）

3 讨论

2005～2011年厦门地区食物中毒副溶血性弧菌的主要流行菌型为O3∶K6、O4∶K8，这7年25起食物中毒事件的标本中分别有 16 和 5 起分离到菌株，而且几乎每年都有，这与国内黄彦等[7]的报道类似。部分菌株（KUT）K抗原未能分型，可能是菌株在保存尤其是常温保存的过程中抗原表达或基因位点发生变异，或者现有分型血清种类的局限，例如第 20 起（2010年8月）食物中毒事件额标本分离到 7株菌，有两株为KUT，但在随后PFGE分型中带型高度一致，达97.3%，与其余5株菌最多仅有3个条带的差异，可能是在K抗原编码基因内发生了个别酶切位点的变异，但根据 Tenover等[8]的判断原则，这些菌株属于相同的克隆群。

副溶血性弧菌的毒力基因虽然不仅包括tdh，还包括trh、毒力岛等，但其tdh编码的耐热直接溶血素是与致病力最为密切的相关致病因子，而在本实验中89.9%的患者菌株都携带tdh基因，也恰好印证了这一观点。虽然Ottaviani等[9]报道了不带毒力基因的副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，但是在国内大部分的暴发事件分离到的菌株中毒力基因的携带率达到了85%以上[9]，所以在食物中毒事件暴发时，除了对样品进行病原菌检测外，检测tdh等毒力基因有利于分析和确认中毒事件的病原。

在25起食物中毒中，单一血清型感染和混合血清型感染各占一半左右，这种多血清型混合感染的食物中毒事件也常有报道[10-14]，然而同一起食物中毒中分离到的菌株有可能是患者自身携带的，也有可能是食品标本中存在的非致病菌，要验证其是否与暴发相关则需要采用其他方法进一步分析。本文以PFGE同源性分析，B群为PFGE分型的优势型别，O3∶K6血清型占大部分，O4∶K68、O1∶K25及部分 O4∶K8、O1∶KUT菌株也同属于这个群，且菌株间相似度较高，这表明这些菌株有着较高的同源性，极有可能是来自于同一个菌株克隆，即 O3∶K6克隆群，而国外也报道了自1995年分离到O3∶K6株已经形成了包括O3∶K6及其衍生血清型的O3∶K6克隆群，其中就涵盖了上述血清型[15]。在第4起和第11起食物中毒中，厨具或食品分离株与患者分离株有着相似度达97.3%的带型；而同时检出多种血清型的其他事件中，非临床标本来源的菌株与患者分离株带型相似度较低，说明中毒事件可能仅与其中的一个血清型相关，而其他血清型（特别是tdh-）菌株可能不是致病原因。

此外，单独对O3群菌株进行聚类分析可以得到相似度较高但年代分布不同的两个群，说明厦门这几年来引起食物中毒的主要菌株一直是源于本地，只是该型菌2009年后发生了2～3个酶切位点变异。

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[7] 黄彦，唐振柱，李秀桂，等.我国食物中毒副溶血性弧菌流行株血清型及分子分型现况[J].职业与健康，2013，29（8）：998-1000.

[8] Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis： criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol，1995，33（9）：2233-2239.

[9] Ottaviani D，Leoni F，Serra R，et al.Nontoxigenic Vibrio parahaemolyticus strains causing acute gastroenteritis[J].J Clin Microbiol，2012，50（12）：4141-4143.

[10] 方伟.2004～2007年广东省副溶血弧菌血清分型、分子特征及溯源研究[D].广州：暨南大学，2009.

[11] 李婧.我国部分地区不同来源副溶血弧菌的分子分型及遗传变异研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2012.

[12] 孙永祥，丁水军，罗芸.PFGE法分析多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒[J].中国卫生检验杂志，2011，21（10）：2444-2445.

[13] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（4）：776-780.

[14] 帅慧群，张睿，詹丽.多血清型副溶血性弧菌引起食物中毒的毒力基因检测和分子分型[J].中国卫生检验杂志，2013，23（18）：3524-3529.

[15] Nair GB，Ramamurthy T，Bhattacharya SK，et al.Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3∶K6 and its serovariants[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：39-48.

（收稿日期：2014-05-05 本文编辑：许俊琴）

3 讨论

2005～2011年厦门地区食物中毒副溶血性弧菌的主要流行菌型为O3∶K6、O4∶K8，这7年25起食物中毒事件的标本中分别有 16 和 5 起分离到菌株，而且几乎每年都有，这与国内黄彦等[7]的报道类似。部分菌株（KUT）K抗原未能分型，可能是菌株在保存尤其是常温保存的过程中抗原表达或基因位点发生变异，或者现有分型血清种类的局限，例如第 20 起（2010年8月）食物中毒事件额标本分离到 7株菌，有两株为KUT，但在随后PFGE分型中带型高度一致，达97.3%，与其余5株菌最多仅有3个条带的差异，可能是在K抗原编码基因内发生了个别酶切位点的变异，但根据 Tenover等[8]的判断原则，这些菌株属于相同的克隆群。

副溶血性弧菌的毒力基因虽然不仅包括tdh，还包括trh、毒力岛等，但其tdh编码的耐热直接溶血素是与致病力最为密切的相关致病因子，而在本实验中89.9%的患者菌株都携带tdh基因，也恰好印证了这一观点。虽然Ottaviani等[9]报道了不带毒力基因的副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，但是在国内大部分的暴发事件分离到的菌株中毒力基因的携带率达到了85%以上[9]，所以在食物中毒事件暴发时，除了对样品进行病原菌检测外，检测tdh等毒力基因有利于分析和确认中毒事件的病原。

在25起食物中毒中，单一血清型感染和混合血清型感染各占一半左右，这种多血清型混合感染的食物中毒事件也常有报道[10-14]，然而同一起食物中毒中分离到的菌株有可能是患者自身携带的，也有可能是食品标本中存在的非致病菌，要验证其是否与暴发相关则需要采用其他方法进一步分析。本文以PFGE同源性分析，B群为PFGE分型的优势型别，O3∶K6血清型占大部分，O4∶K68、O1∶K25及部分 O4∶K8、O1∶KUT菌株也同属于这个群，且菌株间相似度较高，这表明这些菌株有着较高的同源性，极有可能是来自于同一个菌株克隆，即 O3∶K6克隆群，而国外也报道了自1995年分离到O3∶K6株已经形成了包括O3∶K6及其衍生血清型的O3∶K6克隆群，其中就涵盖了上述血清型[15]。在第4起和第11起食物中毒中，厨具或食品分离株与患者分离株有着相似度达97.3%的带型；而同时检出多种血清型的其他事件中，非临床标本来源的菌株与患者分离株带型相似度较低，说明中毒事件可能仅与其中的一个血清型相关，而其他血清型（特别是tdh-）菌株可能不是致病原因。

此外，单独对O3群菌株进行聚类分析可以得到相似度较高但年代分布不同的两个群，说明厦门这几年来引起食物中毒的主要菌株一直是源于本地，只是该型菌2009年后发生了2～3个酶切位点变异。

[参考文献]

[1] 罗贤如，黄薇，张锦周，等.深圳市2006～2010 年食物中毒情况分析[J].现代预防医学，2013，40（12）：2231-2233.

[2] 李孝权，李钏华，邓志爱，等.广州地区七年细菌性食物中毒的病原特征研究[J].中国卫生检验杂志，2011，21（3）：622-624.

[3] 黄芳，许少洪，李映霞，等.2009-2012年海珠区副溶血性弧菌食物中毒特征分析[J].中国公共卫生管理，2013， 29（5）：604-605.

[4] 刘秀梅.食源性疾病监控技术的研究[J].中国食品卫生杂志，2004，16（1）：3-9.

[5] 孙吉昌，游兴勇，刘成伟，等.一起由副溶血性弧菌致群体性食物中毒的调查报告[J].中国食品卫生杂志，2012， 24（1）：89-91.

[6] Centers for Disease Control and Prevention （CDC）.Vital signs：incidence and trends of infection with pathogens transmitted commonly through food-foodborne diseases active surveillance network，10 U.S. sites，1996-2010[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2011，60（22）：749-755.

[7] 黄彦，唐振柱，李秀桂，等.我国食物中毒副溶血性弧菌流行株血清型及分子分型现况[J].职业与健康，2013，29（8）：998-1000.

[8] Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis： criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol，1995，33（9）：2233-2239.

[9] Ottaviani D，Leoni F，Serra R，et al.Nontoxigenic Vibrio parahaemolyticus strains causing acute gastroenteritis[J].J Clin Microbiol，2012，50（12）：4141-4143.

[10] 方伟.2004～2007年广东省副溶血弧菌血清分型、分子特征及溯源研究[D].广州：暨南大学，2009.

[11] 李婧.我国部分地区不同来源副溶血弧菌的分子分型及遗传变异研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2012.

[12] 孙永祥，丁水军，罗芸.PFGE法分析多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒[J].中国卫生检验杂志，2011，21（10）：2444-2445.

[13] 邓冬云，梁景涛，杨启，等.多型别副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（4）：776-780.

[14] 帅慧群，张睿，詹丽.多血清型副溶血性弧菌引起食物中毒的毒力基因检测和分子分型[J].中国卫生检验杂志，2013，23（18）：3524-3529.

[15] Nair GB，Ramamurthy T，Bhattacharya SK，et al.Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3∶K6 and its serovariants[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：39-48.

（收稿日期：2014-05-05 本文编辑：许俊琴）