时间分辨荧光免疫分析法的研究进展及在临床医学领域的应用

蔡美玲，李登红，农丽松，黄光强，王洪涛

巴迪泰（广西）生物科技有限公司 （广西南宁 530031）

20 世纪60 年代初发明的标记免疫分析法，是一种将多种生物标记、示踪技术与医学免疫抗原抗体相结合而产生的新方法，被广泛应用在疾病诊断和疗效观察领域。目前，标记免疫分析法主要包括酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，EIA）、放射免疫分析法（radio immunoassay，RIA）、化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、电化学发光免疫分析法（electrical chemiluminescent immunoassay，ECLIA）、时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）[1-2]。在上述方法中，TRFIA是于20世纪80年代中期发明的一种超微量荧光标记技术，其对试验样品自然荧光强度的影响较小，具有灵敏度高、特异性强、标记物易生产、试剂使用货架期长、无放射性化学危害、重复性好、操作方法简便、区分度好和应用范围广等优点，成为自放射免疫分析之后所实现的又一次崭新的技术转折点，并且灵敏度也大大地超过了放射性同位素的最高极限（表1），是一种极具潜力的超微量检测手段。这种灵敏度高、准确性好、性能稳定的超微量分析法，不管是对食品中有毒有害物质的检测，还是对环境中的痕量气体有毒元素的测定，又或是对生物体内各种功能抑制因子的定性分析，甚至是对人类自身疾病的诊断都具有重大意义[3]。

表1 标记免疫分析法的检测灵敏度

1 TRFIA 的原理及优势

TRFIA 的原理是以三价镧系元素离子或其螯合物为标记物来标记抗体、抗原或其他各种具有生物活性的靶细胞，待反应体系（抗原抗体反应、生物素-亲和素反应等）发生后，用TRFIA 分析检测器测定产物的荧光强度，与对照荧光强度进行对比来推算出反应体系中待测物的浓度[4-5]。

与传统的免疫分析法比较，TRFIA 的优势主要体现在以三价镧系元素离子或其螯合物为标记物所具有的独特理化特性，具体优势如下：（1）镧系元素或其螯合物的荧光寿命长，是其他荧光团的103～106倍（表2），能降低试验样品或试剂本身的荧光寿命，提高灵敏度；（2）激发光和发射光的Stokes 位移大于200 nm（普通荧光Stokes 位移28 nm） （表3），能够消除激发光和发射光的干扰；（3）镧系元素或其螯合物荧光强度比值的特异性高，能有效降低各种来自不同背景光的干扰；（4）镧系元素离子标记物体积小，既保证了被检测物质的稳定性，又能实现多位点标记；标记物稳定，能够对标记物进行多次激发，将荧光信号累加后取平均值的方法，大大提高了准确性；（5）镧系元素离子标记物能够有效保存1～2年，克服了其他免疫分析方法不稳定的缺点。

表2 常见荧光团的荧光寿命

表3 镧系元素螯合物激发光波长、发射光波长和Stokes 位移

2 TRFIA 的反应模式

目前，TRFIA 的反应模式目前应用最广泛的是夹心法和竞争法[6-7]。夹心法大多数用于测定样品中的各种蛋白与大分子物质，而竞争法则大多用于检测与抗体结合的各种小分子物质及半抗原。反应模式流程如图1、图2所示。

图1 夹心法反应流程

图2 竞争法反应流程

3 TRFIA 的研究进展

3.1 酶放大的TRFIA

1992年发明的酶放大的TRFIA 是以5-氟水杨酸磷酸酯（5-fluorosalicylate phosphate，FSA）作为底物，用碱性磷酸酶分子对其催化，与Tb3+相互反应生成三元荧光络合物（FSA-Tb3+-EDTA），在紫外光的激发条件下，即使不加增强液，在时间分辨荧光仪上也能够检测出荧光络合物Tb3+的荧光信号[8]。赵启仁[9]等使用酶放大的TRFIA 对核酸扩增以及磷酸酶的荧光进行测定，灵敏度超过10 pg 。

3.2 双标记及多标记的TRFIA

在目前的荧光标记分析法中，双标记及多标记的TRFIA 仍然是独一无二的，它充分利用镧系离子之间不同的荧光波长和最大的荧光离子衰变持续时间的巨大差别，引入了两种或两种以上的镧系离子标记物，因此它们可以同时检测出同一样品中的不同化合物。常用于双标记的镧系离子有Sm3+和Eu33+、Eu3+和Tb3+[10]。Xu 等[11]提出的荧光离子增强液分别实现了以上两种双重标记，同时灵敏度也不受影响。多标记测定分析技术具有省时、节约实验成本两大特点，可广泛用于多种珍贵分子的生物筛查检测实验[12-13]。

3.3 链霉亲和素-生物素系统的TRFIA

链霉亲和素（streptavidin，SA）不带糖基、等电点低，并且在待测物的检测过程中的背景远远低于亲和素（avidin，AV），最大限度地提高了灵敏度[14]。由于SA-biotin 荧光系统同时可与抗原、抗体、报告酶等待测物质反应，使其在生物检测系统中使用广泛。1998年建立的SA-biotin 系统的TRFIA 技术测定人体血液中玻尿酸的含量，最低检出限小于0.24 mg/L，并且在科研以及医疗行业，常用血液中的玻尿酸的浓度作比对。

3.4 固相的TRFIA

为了克服解离增强镧系元素荧光免疫分析（dissociation enhanced lauthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）的缺点，而建立的固相的TRFIA，它以4，7-二氯磺基苯-1，10二氮杂菲-2，9 二羧酸（4，7-bis-chorosulfophenyl-1，10-phenanthroline-2，9-dicarboxylic acid，BCPDA） 为螯合剂，连接Eu3+和多种蛋白质，制备一种稀土元素标记的免疫分析复合物，从而实现固相测定[15]。因为BCPDA 分子结构中含有一个部位可与Eu3+相连形成BCPDAEu3+螯合物，此螯合物本身就具有强化荧光的功能，所以无需额外添加荧光增强液，就可以直接检测这种复合物的荧光特征信号。目前，利用这种螯合物对皮质醇、肠腺等病毒以及茶碱开展了测试。文献报道标记的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），也是使用BCPDA 新型双向功能螯合物，对固相的TRFIA 技术进行研究，减少背景对荧光干扰，提高检测荧光的灵敏度[16]。

3.5 TRFIA 与激光技术联用

TRFIA 与激光技术联用主要是通过脉冲激光和其他荧光特性检测系统相互结合而产生的。7-碘-8-羟基喹啉-5-磺酸和8-羟基喹啉-5-磺酸都可以与Al、Zn、Mg、Cd 等各种金属离子反应形成络合物。在不同介质、不同增敏剂的作用下，荧光络合物产生不同的荧光特性。Yu 等[17]在此基础上，成功建立了一种基于Al、Zn、Mg、Cd 的联用激光-TRFIA 测定方法。另外，将1.5 ml 0.1 mol/L 的柠檬酸钠加入到pH=6的NaAc-HAc 缓冲体系中，检测不到Al3+和Mg2+的荧光强度，而几乎不影响Zn2+荧光的测量结果。

3.6 TRFIA 与聚合酶链式反应技术连用

TRFIA 与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术相结合，简称PCR-TRF，使得检测PCR 生成物更为简便，广泛用于与PCR 联用的检测方法,包括套叠式PCR-TRF、双标记PCR法、PCR-TRFS 直接定量法、时间分辨荧光扫PCR与TRFIA 联用来检测病毒的核酸[18]。研究人员开展的PCR 扩增实验，是用Eu3+标记寡核苷酸引物，不用进行其他实验步骤，就能够直接检测，不仅优化了操作方法，还提高了PCR 的灵敏度和特异度。

4 TRFIA 在临床医学上的应用

4.1 在病原微生物方面的应用

在传染性疾病的预防检测和治疗研究领域中，TRFIA 应用越来越普遍，比如，建立的TRFIA 法测试甲肝病毒（hepatitis a virus，HAV）、乙肝病毒（hepatitis b virus，HBV）、丙肝病毒、流感病毒等[19]。2005年研制出了以双抗体夹心法的TRFIA技术，用该技术检测新型冠状病毒SARS-CoVN 抗原，结果显示灵敏度达0.02 ng/ml。近年来国内研究者建立了TRFIA 法对检测限较低的乙肝五项标志物进行了测定，对乙型肝炎病毒感染的诊断、疗效的观察及预后的判断有较大价值。

4.2 检测肿瘤标记物的水平

通过TRFIA 测定人体肿瘤标志物的水平来检测癌症病变[20]，包括甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原CA125等。CA125是一种肿瘤相关抗原，许多相关疾病均可引起其升高，作为一种广谱的标志物，82.2%卵巢癌、58%胰腺癌、32%肺癌及其他非妇科肿瘤皆有不同程度的升高。2005年研制出的CA125时间分辨荧光免疫分析试剂盒，在0～2000 U/ml 的范围内没有出现HooK 效应，且目前很少报道大于2000 U/ml 浓度的病例，因此大大提高了临床诊断的可靠性；该试剂盒的灵敏度较高，可以达到1.07 U/ml；对于卵巢癌这类恶性程度很高的肿瘤来说，该试剂盒为其早期诊断、判断疗效和预后提供了重要依据。

4.3 在激素类方面的应用

用TRFIA 检测人类人绒毛膜促性腺激素，灵敏度远远比RIA 高，激素的免疫测定也因此获得了重大突破[21]。目前已用TRFIA 检测了促甲状腺激素、人绒毛膜促性腺激素、17α-羟孕酮、前列腺激素、促黄体激素等。而目前TRFIA 不但在人血清激素的检测中使用普遍，还常用来测定动物血清激素，比如对犬类血清中的游离甲状腺素4（free thyroxine 4，FT4）进行了测定。

4.4 用于检测先天性甲状腺功能低下症

先天性甲状腺功能不足症是由于不可控因素使甲状腺的发育有变或代谢产生功能障碍，从而无法形成相应的甲状腺素而导致生长发育缓慢，甚至智力发育迟钝。该病在新生儿期往往不易引起家长甚至医师的注意而延误诊断或治疗，因此影响患儿的大脑发育。目前，临床上在检测甲状腺功能低下症时多采用心电图检测、功能检查、血清甲状腺激素水平检测等。TRFIA 法是一种可对其作出早期诊断的有效方法[22-23]，通过采用TRFIA 对患者血清做甲状腺功能检测，当镧系离子螯合物与血清里的甲状腺激素结合时会产生一种胶状分子团，该分子团会在紫外光激发下显示出较强的荧光，能够明显加强信号值，从而提高检测结果的准确性。

4.5 用于检测唐氏综合征

应用TRFIA 对妊娠孕妇的血清进行生物标记，进行产前唐氏综合征的筛选，是一项无创伤性的检测手段[24]。对比早孕妊娠女性血清中的相关蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）的比例变化对研究唐氏综合征，甚至流产的早期治疗和监测都有很大的实用价值。通过采用TRFIA 检测血清中PAPP-A，结果显示，孕早期妇女血清PAPP-A 水平随孕周增加而呈上升趋势（P＜0.05），随孕妇年龄增长而呈下降趋势（P＜.05），随体质量指数增加而呈下降趋势（P＜0.05），因此，TRFIA 可作为孕早期唐氏筛查的一项评价指标，对妊娠结果预判有一定参考价值。相对于传统唐氏筛查，通过TRFIA 测定孕早期妇女血清PAPP-A 水平，可有效提高唐氏综合征检出率，且对胎儿无创伤，对筛查出的高危孕妇进一步采取核实确诊，避免了对所有孕早期妇女进行有创检查，从而降低了产前诊断的盲目性。

4.6 用于检测寄生虫

早在1987年就有报道使用TRFIA 和ELISA 两种方法分别对包虫病患者血清、其他寄生虫患者血清及健康患者对照血清进行测试，结果TRFIA 法的阳性检出率可达95.1%，高于ELISA 法的81.4%，因此TRFIA 法的灵敏度高于ELISA 法。2014年，Xu 等[25]建立的TRFIA 能够检测华支睾吸虫重组谷胱甘肽转移酶2蛋白的抗原，灵敏度能够达到95.80%，特异度为93.6%，与交叉反应物质（如血吸虫、鞭虫等）的交叉反应不超过10%。

4.7 其他

TRFIA在其他医学领域中曾被广泛用来检测p-淀粉样蛋白分泌抑制因子、体液中的组胺、肿瘤坏死因子等的浓度含量[11]；也有研究人员使用该技术对端粒酶的活性以及心肌类项目（如肌钙蛋白T：Troponin T）进行测定[26]。

5 总结与展望

TRFIA 技术是一种灵敏度高、特异度好、安全有效的超微量物质分析测定方法，经过40年的迅速发展，已成为临床医学检测的主要技术手段。相信随着生物医学与检测技术的迅速发展、交叉学科更深入的融合、检测设备更加广泛的应用以及各种检测试剂盒的不断研发，TRFIA 技术将得到更进一步的发展，推出越来越多更完善、更简便的检测方法，在医疗领域或其他领域发挥更大的价值。