稻蟹共生系统对土壤微生物多样性的影响

刘乃更，廖 睿，杨占全，梅 杰，李晓东,，3，胡清彪,3

(1.盘锦光合蟹业有限公司，辽宁省中华绒螯蟹育种重点实验室，辽宁盘锦 124200；2.沈阳农业大学动物科学与医学学院，辽宁沈阳 110866；3.辽宁盘锦湿地生态系统国家野外观测研究站，辽宁沈阳 110866)

稻渔共生系统是人类利用稻田浅水环境将水稻和水生生物种养在同一稻田空间而形成的独特稻作系统[1]。2010 年以来，稻渔综合种养产业的发展得到国家政策、技术推广、科学研究多方面的强有力支持[2]，如今在我国有各式各样的稻田种养复合生态系统，主要以稻田养鱼、稻田养虾、稻田养鸭和稻田养蟹为主[3]。稻蟹种养在温度相对冷凉的东北地区及宁夏黄河罐区发展较快，尤其是以辽宁盘锦为主要代表，形成了稻蟹双赢的“盘山模式”[2]，带动了我国北方地区稻蟹种养新技术的发展。2018年辽宁省稻蟹种养面积全国排名第一[2]。

稻蟹综合种养是以水稻生产为主体，同时适量放养中华绒螯蟹(河蟹)，达到一田两用，一田两收的效果。稻渔综合种养可以改善稻田土壤的理化性状，延长水稻生育期，增加生物量[4-6]。土壤微生物是物质循环的调节者，在土壤有机物的分解和养分循环中起重要作用[7-9]。稻蟹共生系统可以降低土壤容重，提高土壤中有机质的含量，且水稻产量高于常规单作稻田[10]，佟德利等[11]研究了水稻不同生育期根际微生物区系的变化，同时也研究了稻蟹生态种养对水稻根际微生物区系的影响[12]， 但只针对成蟹养成阶段的根际土壤区系，目前尚未有针对河蟹从大眼幼体投入稻田到成长为幼蟹阶段(扣蟹)的稻田土壤微生物的研究。该研究通过对稻蟹(扣蟹)共作稻田及单作稻田土壤微生物进行分离鉴定，揭示稻蟹共生系统对土壤微生物的影响，为后期稻蟹综合种养提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验田位于辽宁省盘锦市盘锦光合蟹业有限公司稻蟹种养科学试验田(取样点坐标：北纬40°54′3″，东经121°50′37″)，供试水稻为盘锦当地种植较为广泛的耐盐碱水稻品种“盐丰47号”，供试稻田为稻蟹(扣蟹)共作稻田和单作稻田两种模式。中华绒螯蟹幼蟹由盘锦光合蟹业有限公司提供(中国第一个中华绒螯蟹新品种“光合1号”)。

1.2 试验设计

土壤采集时间为2021年4月15日。采用S型5点取样法采集4次表层土壤(0～20cm)，将每次采集的土样进行风干处理，再转移到2mm的土筛上过筛混匀，筛出土壤中的石子和植物根系等杂质，两种模式土样各采集10g。如果最后过筛剩余土样过多，采用常用的四分取样法，将土样置于光滑平面上进行处理，首先均匀土壤厚度，同时规整成正方形，接下来沿两条对角线将土壤均分为4份等量土壤，再取相对两份土壤，执行上述相同操作，多次重复，直至每份重量与取样量相近再进行取样。

1.3 土壤pH测定

土壤pH测定时称取2mm孔径筛的风干试样10g于50mL高型烧杯中，加入无CO2的纯水25mL(土液比为1:2.5)，用搅拌器搅拌1mins，使土粒充分分散，放置30mins后进行测定。通过pH计(上海雷磁PHS-3C)进行pH测定，读取读数为样品土壤pH值，所测结果通过SPSS 20.0进行单因素ANOVA分析。

1.4 培养基的制作

选用PDA培养基、改良高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基和牛肉膏蛋白胨培养基(青岛海博生物公司)。制备的培养基灭菌后分别倒入3个平板，本试验均在无菌条件下操作，移液枪吸取0.1mL相应浓度土壤稀释液(牛肉膏蛋白胨培养基选用10-5～10-7的土壤稀释浓度，其他三种培养基均使用10-3～10-5的土壤稀释浓度)接种在平板上，涂布均匀。分离、提纯培养优势菌群，挑取几种比较典型的优势菌落接种于相应的平板，培养条件如表1。

表1 培养基及条件

1.5 活菌计数

用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，记录各个平板的菌落总数。经过培养基培养，统计培养皿菌落数目，活菌总数除以培养基滴加的稀释液体积(0.1mL)再乘上稀释倍数，所得结果即活菌数。参照钟文辉等[13]的方法，选用Shannon-Wiener多样性指数(H)、物种丰富度指数(S)和Simpson优势度指数(D)讨论两种养殖模式土壤的微生物多样性特征。

1.6 基因扩增

采用DNA提取试剂盒对不同菌落进行总DNA的提取(天根生化科技(北京)有限公司)。该试验用于细菌16S DNA基因扩增的引物序列[14]为：27F：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，扩增程序为：94℃预变性4mins；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，持续30个循环；最后72℃末端延伸10mins。

用于真菌18S DNA基因扩增的引物序列[15]为：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，扩增程序为：94℃预变性5mins；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，持续35个循环；最后72℃末端延伸7mins。

1.7 测序比对

将PCR扩增后含有目的片段的扩增产物送生工测序，测序所得序列于DNAman进行正反拼接，根据测序所得序列在NCBI中进行基本局部序列比对(Basic local alignment search tool，BLAST)，验证目的片段是否有细菌或真菌片段，根据比对结果进行微生物菌群的种属鉴定。

2 结果与分析

2.1 两种稻田土壤pH值

通过对无蟹稻田和稻蟹共作土壤pH的检测，发现无蟹稻田比有蟹稻田土壤pH略高(表2)，但差异不显著(p>0.05)。

表2 两种稻田土壤样本pH值

2.2 活菌计数

培养基活菌数显示了不同菌群的数量，突显出个别菌群的优势，无菌土壤和扣蟹土壤样品中的活菌数如表3、表4所示。

表3 无蟹土壤样品的活菌计数

表4 扣蟹土壤样品的活菌计数

无蟹稻田土壤中有19种菌的活菌数大于103个/每克土壤，其中有12种菌的活菌数大于104个/每克土壤，有8种菌的活菌数大于105个/每克土壤，有4种菌的活菌数大于106个/每克土壤(表3)。

稻蟹共作土壤中有31种菌的活菌数大于103个/每克土壤，其中有9种菌的活菌数大于104个/每克土壤，有4种菌的活菌数大于106个/每克土壤(表4)。

从无蟹稻田和稻蟹共作的土样中分离培养出来的菌群在培养基上呈现的菌落形态各异，有的表面光滑，有的表面粗糙，有的边缘整齐，有的菌落边缘无规则，大小和颜色也各不相同，由此将不同表型的菌落进行标号提纯培养，并通过16S rDNA、18S rDNA进行菌种扩增鉴定。

根据Shannon指数和Simpson指数计算公式得到结果如表5。发现无蟹稻田Shannon-Wiener多样性指数(H)要高于稻蟹共作，但物种丰富度(S)及Simpson优势度指数(D)低于稻蟹共作。

表5 不同土壤类型菌类多样性、丰富度和优势度指数比较

2.3 测序结果统计

无蟹稻田和稻蟹共作土壤细菌组成种类存在较大差异(表6)。无蟹稻田土壤和稻蟹共作土壤的共同细菌有3种，分别为叶球形微杆菌(Microbacteriumglobosum)、水生芽孢杆菌(Bacillusaquimaris)、假单胞菌(Pseudomonassp.strain)。无蟹稻田存在3个细菌属，分别为微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)；稻蟹共作存在9种细菌菌种，隶属于5个属，分别为微杆菌属(Microbacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和乳酸杆菌属(MicrobacteriumII)。其中稻蟹共作土壤特有3种细菌，分别是乳酸杆菌(Microbacteriumlacusstrain)、氧化微杆菌(Microbacteriumoxydansstrain)和节杆菌(Arthrobactersp.)。

表6 土壤细菌区系

无蟹稻田和稻蟹共作土壤真菌组成种类存在较大差异(表7)。无蟹稻田土壤和稻蟹共作土壤的共同真菌属有4种，分别为枝孢菌属(Cladosporiu)、蓝状菌属(Talaromyces)、短梗霉菌属(Aureobasidium)、粘霉菌(Vishniacozymacarnescens)。无蟹稻田存在15种真菌，隶属于10个属，其中枝孢菌属(Cladosporium)包含4种、青霉菌属(Penicillium)包含2种、链格孢菌属(Alternaria)包含2种等。无蟹稻田土壤特有6种真菌，分别为苦荞酵母菌(Buckleyzymaaurantiacastrain)、美链霉菌(Talaromycesamestolkiae)、短密青霉菌(Penicilliumbrevicompactum)、枝孢菌属(Cladosporiumsp.)、假枝孢菌(Cladosporiumpseudocladosporioidesstrain)、链格孢(Alternarianees)。稻蟹共作存在19种真菌，隶属于10个属，其中枝孢菌属(Cladosporium)包含5种、链格孢菌属(Alternaria)包含4种，被孢霉菌属(Mortierella)和曲霉属(Aspergillus)均包含2种。稻蟹共作土壤特有10种真菌，其中包含1种不同的枝孢菌属(Cladosporium)以及2种不同的链格孢菌(AlternariaNeessp.)，除此之外还有疣孢蓝状菌(Talaromycesverruculosus)、被孢霉(Mortierella)、隐球菌属(Cryptococcussp.)、灰绿青霉(Penicilliumglaucum)、单胞菌(Monospora)、詹森曲霉(Aspergillusjenseniistrain)、细交链格孢(Alternaria)。

表7 土壤真菌区系

3 讨论

3.1 稻蟹共作对土壤pH值的影响

稻田土壤微生物是稻田土壤生态系统重要的组成部分，有研究发现，水产养殖动物可以通过摄食及排泄等生命活动有效改善土壤的透气性和土壤细菌营养条件，进而提高了土壤微生物的多样性和活性[16, 17]，该研究两种稻田类型土壤样本的pH值发生了变化，表现为与水稻单作(无蟹稻田)相比，稻蟹共作(稻蟹共作)的pH下降，但差异不显著，这与宋宇等[18]研究结果河蟹共作稻田和龙虾共作稻田的pH均低于水稻单作一致，但差异显著性不一致，该研究稻田养殖河蟹阶段为大眼幼体到扣蟹阶段，推测可能受稻田中河蟹规格大小影响。

3.2 稻蟹共作对土壤微生物的影响

土壤理化性质会影响微生物的生长活性[19]，本研究发现稻蟹共作土壤比无蟹稻田土壤中的细菌种类和真菌种类均高于无蟹稻土壤，这与佟得利等[12]的研究结果一致。土壤的性质影响土壤微生物的多样性，而微生物的多样性也反作用于土壤的功能[20, 21]，稻蟹共作模式可以改善土壤的生态环境，本次研究发现不同稻蟹种养科学试验田中的细菌和真菌的群落结构组成及种类存在一定的相似性，但也存在差异，从属的分类地位来看，稻蟹共作土壤细菌中微杆菌属和节杆菌属为优势菌，真菌枝孢菌属和链格孢菌属为优势菌。王伏伟[22]通过高通量测序对施肥及秸秆还田细菌群落的研究表明，不施肥情况下，小麦秸秆还田和不还田的优势菌门为放线菌门、拟杆菌门、变形菌门和酸杆菌门，这一试验结果与本结果相似，表明稻蟹共作具有还田的效用。

河蟹的活动会疏松土壤，达到增氧的效果，即稻田养蟹会提高稻田环境的溶解氧浓度，有研究结果表明[19, 23, 24]，在一定范围内，溶解氧浓度的升高可促进被孢霉的生长，在低溶氧时，溶解氧的传递受到被孢霉的菌丝抑制，同时也不利于被孢霉的生长。该研究中稻蟹共作土壤中发现了被孢霉，而在无蟹稻田土壤中未发现，可能与河蟹活动有关。

该研究中稻蟹共作土壤较无蟹稻田土壤pH值有下降趋势，研究表明[25]土壤pH值与细菌群落结构和数量关系密切，是造成土壤间细菌群落和数量差异性的主要原因。河蟹排泄物中富有有机养分，可以提高土壤肥力，从而降低土壤的酸碱度，研究表明[10]，稻蟹共作土壤的pH会比普通稻田土壤的低。红曲霉菌丝体含有多种营养物质，红曲霉可在酸性环境下生存繁殖，最适pH是4～5[26]，由此推断，稻蟹共作较无蟹稻田中的红曲霉的数量高的原因可能是受pH影响。两种稻田土壤中均存在水生芽孢杆菌，其在不利条件下其产生芽孢，条件适当可发展为营养体，有氧无氧条件下均可生存。水生芽孢杆菌可促进植物的生长。

链格孢菌属大部分种类不利于农作物的生长，可寄生在农作物上引起病害，导致农作物产量及质量下降，也有少数链格孢菌具有杀虫、杀菌等作用，虽无蟹稻田和稻蟹共作均存在链格孢菌，但稻蟹共作的链格孢菌种类和数量都高于无蟹稻田。冯中红等研究表明，链格孢菌受营养物质、pH值等环境因素影响[24]。

该试验稻蟹共作的Shannon-Wiener多样性指数(H)低于无蟹稻田，原因可能是稻蟹共作中微生物种类增加，但优势菌群增强了优势地位，导致H下降。与Shannon指数不同，稻蟹共作稻田土壤的物种丰富度(S)及Simpson优势度指数(D)均高于无蟹稻田，Simpson指数与群落多样性成正比，较弱势及稀有种类对指数影响较低，而优势物种和普遍物种在优势度分析中具有较高影响力，对指数影响大，表明稻蟹共作改变了土壤微生物多样性格局。

4 结论

两种稻田土壤存在细菌和真菌，其中稻蟹共作土壤比单作稻田土壤多6种细菌，且稻蟹共作土壤特有3种细菌，分别是乳酸杆菌、氧化微杆菌和节杆菌，无蟹稻田土壤和稻蟹共作土壤的共同真菌属有4种，其中枝孢菌属和链格孢菌属均是其优势菌。从种类上讲，稻蟹共作土壤比单作稻田土壤多4种真菌，无蟹稻田土壤特有6种真菌，稻蟹共作土壤特有10种真菌。菌群结构表明，养蟹稻田的土壤质量较普通稻田有所提升，主要原因是河蟹的日常频繁活动改变土壤本身的结构，一方面起到松土的作用，另一方面其排泄物对土壤养分产生影响，由于该试验鉴定出的一些菌属现有研究较少，未来还需继续深入研究。