碳量子点及新型半胱氨酸分子印迹传感器的制备*

张育珍，张 博，余 双，白春花，秦 蓓

（西安医学院 药学院，陕西 西安 710000）

半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys）是一种含巯基的氨基酸，其主要功能是参与代谢、蛋白质合成和排毒[1,2]。研究表明，L-Cys水平升高会引发神经毒性疾病，而L-Cys缺乏会导致脱发、肌肉和脂肪减少、嗜睡、浮肿、虚弱和肝损伤等疾病[3-7]。因此，建立高选择性、高灵敏度检测L-Cys在生物化学和生物医学方面具有重要意义。目前，L-Cys检测方法包括高效液相色谱法、毛细管电泳及光学检测[8]。然而，这些方法需要复杂的样品前处理过程，而且谷胱甘肽和高半胱氨酸与L-Cys具有相似的结构，从而难以检测内源性L-Cys[2]。因此，为了解决上述问题必须开发方便、廉价且具有高灵敏度、高选择性的方法来检测L-Cys。

荧光碳量子点（carbon dots，CDs）是碳族中的一种新型零维纳米材料[9]。由于其独特的光学性能、良好的水溶性及生物相容性，被广泛认为是一种优于其他荧光基团的材料[10]。然而，CDs通常对大多数分析物没有选择性，因此，有必要探索合适方法来提高CDs的特异性[11]。目前，基于CDs与分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers,MIPs）相结合的传感器因其低毒、高选择性和高灵敏度受到科研工作者广泛关注[12]。Ghani等[13]基于CDs和MIPs开发了一种选择性测定啶虫脒的荧光法，其检测限可达到0.11nmol·L-1。据报道，以量子点为荧光材料，利用MIPs高选择性检测L-Cys仅有2篇。Chao[14]等人通过烯丙基硫醇封端的CdTe量子点与MIPs嫁接，用于检测血清中L-Cys，检测限可达到0.85μM。Cai等人[15]提出了一种基于化学剂量法的荧光检测方法，结合分子印迹技术与荧光剂量法测定L-Cys。然而，目前报道L-Cys荧光检测方法制备工艺复杂、毒性较大，不利于其进一步发展。

本研究拟采用水热法制备CDs，通过反相微乳法以CDs为荧光传感单元、L-Cys为模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）为功能单体、硅酸四乙酯（TEOS）为交联剂、NH3·H2O为引发剂，制备新型半胱氨酸分子印迹（L-Cys@CDs@MIPs）。随后对CDs和L-Cys@CDs@MIPs进行透射电镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等表征，并利用目标化合物对L-Cys@CDs@MIPs的猝灭效果进行考察，以期建立检测痕量L-Cys的方法。本研究将有助于复杂基质中痕量L-Cys检测，将为与L-Cys相关疾病的预防提供理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光分光光度计（株式会社日立制作所）；Carry60型紫外可见分光光度计（安捷伦科技有限公司），IR-Affinity-1型傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，日本岛津），LAB-1C-50型真空冷冻干燥机（上海甄明科学仪器有限公司）。

L-半胱氨酸（25g，≥98%）、柠檬酸（500g，99.0～102.0%）、正己醇（100mL，98%）、硅酸四乙酯（TEOS，500mL，98%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，25mL，98%），购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；曲拉通X-100（CP国药集团化学试剂有限公司）；环己烷（AR利安隆博华（天津）医药化学有限公司）；无水乙二胺、丙酮、无水甲醇、冰乙酸、NH3·H2O、缩二脲、硫脲、尿素，均为分析纯，天津市河东区红岩试剂厂。

1.2 CDs的制备

将4.0g柠檬酸溶于40mL去离子水中，随后加入2.0mL无水乙二胺，充分混匀后，转移至聚四氟乙烯反应釜中，并在200℃反应5h。反应结束后，用0.45μm微孔滤膜除去大颗粒物，即得CDs水溶液。随后，利用透析袋除去未反应化合物并除杂，最终得到亮黄色透明溶液，即得纯净CDs水溶液，经冷冻干燥得到CDs粉末。

1.3 新型半胱氨酸分子印迹传感器的制备

在50mL试剂瓶中依次加入环己烷8mL、正己醇1.5mL与曲拉通X-1002mL，磁力搅拌30min。随后，加入5mg·mL-1CDs溶液1mL、1.2mmol TEOS和NH3·H2O 100μL的并搅拌2h。然后，向上述溶液中，加入室温下预聚合2h的0.2mmol L-Cys、0.6mmol APTES溶液，磁力搅拌12h。反应结束后，加入10mL丙酮终止反应，并离心收集聚合物，接着用甲醇∶乙酸（9∶1，v/v）溶液除去模板分子L-Cys，随后用甲醇洗至无乙酸味，于烘箱中45℃干燥。L-Cys@CDs@MIPs纳米材料合成步骤见图1。

图1 新型L-Cys@CDs@MIPs制备过程Fig.1 Schematic representation of L-Cys@CDs@MIPs synthesis process

在不添加模板分子L-Cys的情况下，重复以上实验步骤制备非印迹聚合物CDs@NIPs作为对照。

1.4 新型半胱氨酸分子印迹传感器荧光测定

制备的复合材料荧光光谱均在F-4600荧光光谱仪上进行，并在340nm的激发波长下记录荧光强度，在390～600nm的波长范围内测定发射波长。将L-Cys@CDs@MIPs分散在去离子水中，然后将不同浓度的L-Cys溶液加入荧光比色管中，用荧光光谱仪测定荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 CDs的制备

2.1.1 前驱体种类的考察 以柠檬酸、尿素，柠檬酸、硫脲，柠檬酸、缩二脲，柠檬酸、天冬氨酸，柠檬酸、无水乙二胺为前驱体制备CDs。随后，在相同条件下检测其荧光强度。

从表1可知，在相同实验条件下，柠檬酸与无水乙二胺为前驱体，荧光强度最大，因此，选择柠檬酸和无水乙二胺为前驱体制备CDs。

表1 前驱体种类考察Tab.1 Investigation on the types of precursors

2.1.2 前驱体浓度考察 利用不同浓度前驱体柠檬酸和无水乙二胺制备CDs。

由表2可知，随着柠檬酸与无水乙二胺浓度减小，荧光强度也随之减少，当柠檬酸与无水乙二胺分别为2.0g和1.0mL时，荧光强度为3221，故选择上述浓度进行后续实验。

表2 前驱体浓度考察Tab.2 Investigation on the concentration of precursors

2.1.3 CDs电镜表征 采用超分辨透射电镜图（TEM）对制备CDs的形貌和粒径分布进行了表征。图2为CDs的TEM图。

图2 CDs透射电镜图Fig.2 TEM of CDs

从图2中可知，CDs呈球形、尺寸均匀、大小均一。

2.1.4 CDs红外表征 采用傅里叶变换红外（FI-IR）光谱及KBr压片法对CDs进行红外表征。

从图3可知，在3404cm-1处为C-OH伸缩振动峰，在2923cm-1处的吸收峰为C-H伸缩振动峰，在1699cm-1处的吸收峰是由C=O伸缩振动引起的，1564cm-1处 为N-H的 弯 曲 振 动 峰，1400cm-1处为-OH伸缩振动峰，1166cm-1处为C-NH-C的伸缩振动。因此，表明CDs已经制备成功且CDs表面含有羟基、羰基以及氨基基团[16]。

图3 CDs红外表征图Fig.3 FT-IR spectra of CDs

2.1.5 CDs荧光性能 在不同激发波长下对CDs的荧光强度进行考察，结果见图4。

图4 （a）CDs在300～400nm荧光发射光谱（b）CDs最佳激发和发射光谱（c）CDs的紫外吸收光谱Fig.4（a）Fluorescence emission spectra of CDs from 300nm to 400nm（b）Fluorescence excitation and emission spectra of CDs（c）Ultraviolet absorption spectrum of CDs

由图4（a）可见，CDs荧光强度随着激发波长从300nm到400nm的增加，荧光强度先增加后减弱，在激发波长为340nm时，CDs的荧光强度最强。随后对CDs进行紫外-可见吸收光谱考察，图4（c）可知，由于双键的π-π*跃迁，CDs在340nm左右出现了明显的特征吸收峰，与CDs的激发波长一致，得到最佳激发波长。随后在最佳激发波长下，判断最佳发射波长。由图4（b）可见，所制备CDs的最佳激发波长为340nm，所对应的最佳发射波长为444nm，显现出蓝色荧光。

2.2 新型半胱氨酸分子印迹传感器的制备

2.2.1 模板分子与功能单体比例考察MIPs具有预定的识别能力、选择性高，而分子识别取决于模板和功能单体之间的分子间相互作用，因此，功能单体是影响聚合物吸附能力的关键因素[17]。本文将功能单体与交联剂比例固定为1∶2，随后选取6组摩尔比（1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶3，1∶4，1∶5，）进行评估考察，结果见图5。

图5 模板分子与功能单体比例考察Fig.5 Fluorescence intensity of different molar ratios of template-functional monomer

由图5可知，当L-Cys与APTES比例为1∶3时，F0-F差值最大，因此，选择模板分子与功能单体比例为1∶3进行下一步考察。

2.2.2 功能单体和交联剂不同比例的考察 交联剂是分子印迹材料合成过程中重要因素，交联剂使用量的多少会决定制备纳米粒子空间网络疏松紧密程度。本文选择模板分子与功能单体比例为1∶3，随后考察功能单体与交联剂的比例，选取3组摩尔比（3∶3，3∶6，3∶9）进行评估考察，结果见图6。

图6 功能单体与交联剂比例考察Fig.6 Fluorescence intensity of different molar ratios of functional monomer-cross-linker

由图6可知，当APTES与TEOS比例为3∶6时，F0-F差值最大，因此，选择功能单体：交联剂比例为3∶6进行考察。

2.2.3 新型半胱氨酸分子印迹传感器红外表征 采用傅里叶变换红外（FI-IR）光谱及KBr压片法对LCys@CDs@MIPs进行红外表征，结果见图7。

图7 L-Cys@CDs@MIPs红外表征图Fig.7 FT-IR spectra of L-Cys@CDs@MIPs

由图7可知，3406cm-1处为C-OH伸缩振动峰，3126cm-1处为C-H伸缩振动峰，1642cm-1处为C=O伸缩振动峰，1400cm-1处为-OH伸缩振动峰，1070cm-1处为Si-O-Si不对称伸缩振动峰，表明分子印迹层已经形成。

2.2.4 新型半胱氨酸分子印迹传感器电镜表征 采用超分辨透射电镜图（TEM）对L-Cys@CDs@MIPs的形貌进行表征。图8为不同尺寸L-Cys@CDs@MIPs的TEM图。

图8 L-Cys@CDs@MIPs透射电镜图Fig.8 TEM of L-Cys@CDs@MIPs

从图8可知，L-Cys@CDs@MIPs具有粗糙的表面，且发生聚合，尺寸比CDs大很多，进一步表明聚合物已经制备成功。

2.3 新型半胱氨酸分子印迹传感器荧光性能

2.3.1 新型半胱氨酸分子印迹传感器光学性质考察 通过扫描L-Cys@CDs@MIPs不同激发（300～400nm）波长下的发射光谱，研究L-Cys@CDs@MIPs的荧光特性，结果见图9。

图9 （a）L-Cys@CDs@MIPs在300-400nm荧光光谱；（b）L-Cys@CDs@MIPs最佳激发和发射光谱；（c）L-Cys@CDs@MIPs紫外吸收光谱；（d）荧光光谱Fig.9（a）Fluorescence emission spectra of L-Cys@CDs@MIPs from 300nm to 400nm；（b）Fluorescence excitation and emission spectra of L-Cys@CDs@MIPs；（c）Ultraviolet absorption spectrum of L-Cys@CDs@MIPs；（d）Fluorescence emission spectra

由图9（a）和（b）表明，最大激发波长为340nm，而相应的最大发射波长约为440nm。因此，在340nm的激发波长和440nm的发射波长下对L-Cys@CDs@MIPs进行了下一步的荧光测量。由图9（c）可知，L-Cys@CDs@MIPs在340nm左右出现了明显的特征吸收峰，与其激发波长一致，进一步证明该复合材料最佳激发波长为340nm。随后，对L-Cys@CDs@MIPs和L-Cys@CDs@NIPs复合材料进行荧光测定，由图9（d）可知，L-Cys@CDs@NIPs比L-Cys@CDs@MIPs（加L-Cys）显示出更强的荧光信号，并且LCys@CDs@MIPs（未加L-Cys）的荧光强度为L-Cys@CDs@NIPs的86%。这些结果表明，制备的复合材料具有良好的荧光性能，并且成功地从聚合物中去除了L-Cys。

2.3.2 新型半胱氨酸分子印迹传感器荧光测定 图10（a）为不同浓度L-Cys猝灭L-Cys@CDs@MIPs的荧光光谱图。从图10a中可看出，L-Cys可以明显的猝灭LCys@CDs@MIPs荧光强度，且当L-Cys浓度为100μM时，猝灭效果最明显。图（b）是荧光猝灭效果F0-F与不同浓度L-Cys的线性关系图，从图10b中可知，其线性关系为F0-F=2.292C+153.544，R2为0.992。

图10 （a）L-Cys猝灭L-Cys@CDs@MIPs荧光光谱图（b）F0-F与L-Cys线性关系Fig.10（a）Fluorescence emission spectra L-Cys@CDs@MIPs in the presence of different concentrations of L-Cys（from 1 to 100μM）（b）The relationship between F0-F and the concentrations of L-Cys

3 结论

本研究以柠檬酸和无水乙二胺为前驱体，通过简单的水热法一步合成了具有优异荧光特性的CDs，随后对CDs进行TEM表征。结果表明，制备的CDs大小均一、尺寸均匀。对其FT-IR表征，进一步证明CDs已成功制备，而且其表面富含羰基、羧基和氨基等官能团，使得CDs表现出良好的水溶性。利用反相微乳法，以低成本、操作简单方便理念，制备新型L-Cys@CDs@MIPs，并利用目标化合物对新型L-Cys@CDs@MIPs猝灭效果进行考察，结果表明，当模板分子、功能单体与交联剂比例为1∶3∶6时，L-Cys对新型L-Cys@CDs@MIPs的猝灭效果最好。本研究以期建立检测复杂基质中痕量L-Cys的方法，后续将继续优化其最优检测条件，为与L-Cys相关疾病的预防提供理论基础。