乳酸菌发酵龙葵果工艺优化及抗氧化性研究

夏秋霞，段腾飞，田元强，柳雅丽

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州,234000

龙葵别名苦葵，水茄，是一年生草本植物[1]，广泛分布于亚、欧、美洲的温带和热带地区。成熟的龙葵果中含有蛋白质、有机酸、生物碱、皂苷、酚类物质以及多糖等功能性成分[2-5],具有良好的抑菌、抗肿瘤和抗氧化功效[6-9]。乳酸菌极为广泛地分布在自然界中，将乳酸菌应用于饮料制品具有较高研究价值[10]。研究结果表明食品经发酵后抗氧化性增强[11]，主要是因为微生物的代谢会使食品中酚类化合物降解[12]，使得抗氧化性物质增加。近年来对龙葵果发酵方面的研究日趋增加，研究开发龙葵果果酒、果醋和酸奶等发酵类产品越来越多[13-14]。实验以成熟龙葵果为原料，选用嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)发酵龙葵果汁，先进行单因素实验，通过测定感官评定和活菌数作为评定标准，对其进行响应面优化，以期得到一种感官评分高，富含乳酸菌且具有抗氧化性的龙葵果汁，为今后在龙葵果食品中的研究提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料与试剂

材料：嗜酸乳杆菌CICC20250(中国工业微生物菌种保藏管理中心)，龙葵果(宿州市大润发超市)。MRS肉汤、水杨酸钠等均为分析纯。

1.1.2 实验仪器

722S型分光光度计(驰唐精密仪器有限公司)；ZXMP-R1150型恒温培养箱(广州番禺旭东坂田电子有限公司)；SW-CJ-1CU型超净台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

龙葵果清洗→榨汁→过滤→调配→灭菌→接种→发酵→测定

1.2.2 单因素实验

取保存的嗜酸乳杆菌CICC20250于MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h。测定活菌数达到2×108CFU/mL，置于-4 ℃冰箱下保存备用。探究接菌量体积分数(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)、发酵时间(16 h，18 h，20 h，22 h，24 h)、发酵温度(33 ℃，35 ℃，37 ℃，39 ℃，41 ℃)和可溶性固形物含量质量分数(9%，11%，13%，15%，17%)对龙葵果汁品质的影响。

1.2.3 实验指标

感官评分。选择15位专业评定人员组成评定小组，进行感官评定(表1)。

表1 感官评分标准[15-16]

活菌数测定。采用倾注平板计数法[17]，取发酵果汁稀释到10-5、10-6、10-7，然后取1 mL稀释果汁加入培养皿中，并倒入MRS固体培养基混匀，对每个梯度稀释果汁进行三组平行实验，37 ℃培养48 h，进行平板计数，记录实验数据。

1.2.4 响应面分析

以-1，0，1代表自变量水平，发酵龙葵果汁活菌数和感官评分为响应面值进行优化处理(表2)。

表2 因素水平表

1.2.5 发酵龙葵果汁理化指标

在最优发酵条件下每隔2 h取样，测定发酵龙葵果汁中黄酮(硝酸铝法测定)，总酚(福林酚法)，pH，活菌数等。

1.2.6 发酵龙葵果汁抗氧化性研究

(1)发酵龙葵果汁中羟自由基清除能力的测定

H2O2/Fe体系反应法：羟自由基清除能力={[A0-(A1-A2)/A0}×100%

(2)发酵龙葵果汁中超氧阴离子自由基清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法：超氧阴离子自由基清除能力={[A0-(A1-A2)]/A0}×100%

2 结果分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 接菌量对发酵龙葵果汁的影响

嗜酸乳杆菌发酵龙葵果汁在接菌量从0.5%～2.5%的区间里变化明显(见图1)，接入1.5%嗜酸乳杆菌时龙葵果汁中活菌数到达最大值9.0×107CFU/mL并且感官评分达到85分。在接菌量1.0%～1.5%的区间里，龙葵果汁中的活菌数增加12.5%，增加明显。感官评分从72分增加到85分，增加18.1%，口感酸涩变化明显，嗜酸乳杆菌发酵效果明显，口感优良。接菌量大于1.5%时，龙葵果经过发酵后果汁酸度较高，果汁出现浑浊，部分乳酸菌死亡，活菌数下降，最终趋于稳定，果汁口感变差且无果汁香气。综合考虑在接菌量1.5%时嗜酸乳杆菌发酵龙葵果汁的效果最好。

图1 嗜酸乳杆菌接菌量对龙葵果汁发酵的影响

2.1.2 发酵时间对发酵龙葵果汁的影响

从图2得到，发酵时间22 h时龙葵果汁中嗜酸乳杆菌菌数和感官评分达到最高值分别为1.58×108CFU/mL和88分，果汁口感酸甜清香。在20～22 h内龙葵果汁中嗜酸乳杆菌从6.8×107CFU/mL增加到1.58×108CFU/mL提高32.7%，感官评分从78分增加到88分，增加了12.8%，感官评分差距显著。随着时间延长，龙葵果汁中嗜酸乳杆菌的活性下降，在24 h时活菌数下降，果汁浑浊口感粗糙。综合考虑选择发酵时间22 h进行后续实验。

图2 不同发酵时间对嗜酸乳杆菌发酵龙葵果汁的影响

2.1.3 温度对发酵龙葵果汁的影响

从图3得到，在37 ℃时龙葵果汁中嗜酸乳杆菌达到最大值1.58×108CFU/mL，嗜酸乳杆菌活性较佳，感官评分90分，龙葵果汁口感清香，回味酸甜可口。发酵龙葵果汁在35 ℃～37 ℃时，嗜酸乳杆菌从1.18×108CFU/mL增加到1.58×108CFU/mL，增加了33.9%，感官评分从75分增加到90分。在37 ℃～41 ℃，感官评分和活菌数逐渐降低，口感酸涩，颜色浑浊差距较为明显，可能是在超过最适发酵温度后嗜酸乳杆菌活性降低并且少量死亡，口味也逐渐下降，变得苦涩。综合考虑选择发酵温度37 ℃进行后续实验。

图3 温度对乳酸菌发酵龙葵果汁的影响

2.1.4 可溶性固形物对发酵龙葵果汁的影响

从图4得到，可溶性固形物(Soluble solid content,SSC)为13%时，发酵龙葵果汁中嗜酸乳杆菌为1.93×108CFU/mL，感官评分91分，味感清甜，入口微酸，果香宜人。SSC为9%～11%时，发酵龙葵果汁中嗜酸乳杆菌由1.42×108CFU/mL增至1.74×108CFU/mL，增加22.5%。SSC在11%～13%里感官评分从74分增加到91分，味感变化明显，果香清透，入口微酸，色泽明显提高。SSC在13%～17%里龙葵发酵果汁感官评分以及嗜酸乳杆菌数下降，风味酸涩，整体口感变化较大。SSC为17%时果汁口感酸涩有明显浑浊沉淀，综合考虑SSC在13%时嗜酸乳杆菌发酵龙葵果汁最有优势。

图4 可溶性固形物对乳酸菌发酵龙葵果汁影响

2.2 响应面试验优化结果

2.2.1 模型建立及其显著性检验

自变量选择接菌量、果汁发酵时间、果汁发酵温度以及可溶性固形物含量，响应值选择龙葵果汁中活菌数和感官评分(见表3)，进行龙葵果汁发酵工艺优化。

表3 响应面实验表

2.2.2 活菌数方差分析

依据分析，活菌数=190.40-2.17×A+5.92×B-8.92×C-5.00×D+25.50×A×B+5.75×A×C-6.75×A×D+6.00×B×C-5.25×B×D-6.00×C×D-40.41×A2-57.78×B2-53.28×C2-44.91×D2

依据表4所得，试验模型P<0.000 1极显著，失拟项P=0.489 1>0.05，差异不显著，说明实验模型可靠。同时R2=0.992 3，矫正R2=0.984 7，C.V=4.64%<5.00%，证明实验误差较小，实验模型具有可信度。果汁中活菌数受4个不同因素干扰强弱程度为C>B>D>A，表明温度对果汁中活菌数影响最为显著。C、AB、A2、B2、C2、D2对龙葵果汁活菌数影响极显著(P<0.01)，B、D、AC、AD、BC对龙葵果汁活菌数影响显著(P<0.05)。

表4 活菌数方差分析表

2.2.3 感官评分方差分析

依据分析，感官评分=96.60-0.25×A+3.25×B-4.50×C-3.00×D+11.00×A×B+3.25×A×C-3.00×A×D+5.50×B×C-2.25×B×D-1.75×C×D-16.38×A2-23.13×B2-21.01×C2-17.76×D2

依据表5得，试验模型极显著(P<0.000 1)，失拟项P=0.178 3>0.05，差异不显著，说明方程模拟的比较好，模型数据具有可靠性。同时R2=0.987 1，矫正R2=0.974 2，C.V=4.19%<5.00%，证明实验误差较小，实验结果具有可信度。果汁感官评分受四个不同因素影响程度为C>B>D>A，表明温度对果汁中感官评分影响最为显著。C、AB、A2、B2、C2、D2对龙葵果汁感官评估干扰极显著(P<0.05)，B、D、AC、AD、BC对龙葵果汁感官评估分数干扰显著(P<0.05)。

表5 感官评分方差分析表

2.3 发酵龙葵果汁理化性质研究

2.3.1 龙葵果汁pH值变化

从图5看出，在0～22 h时，发酵龙葵果汁pH从4.51减少到3.48，减少22.8%。在0～4 h时，嗜酸乳杆菌活菌数较少，发酵效果不明显，产生乳酸较少，pH下降不明显。在6～14 h时测得龙葵果汁pH下降显著，这与嗜酸乳杆菌明显增加产生大量乳酸有关。在18～24 h时，活菌数趋于稳定，果汁pH下降不明显。综合得到，龙葵果汁发酵过程中pH值下降，符合果汁理化指标，果汁酸甜可口，风味改善明显。

图5 最优发酵条件下龙葵发酵果汁pH变化

2.3.2 龙葵果汁总酚含量的变化

从图6得到，在0～22 h发酵龙葵果汁中总酚含量从1.03 μg/mL增至1.29 μg/mL，增加了25.2%，上升明显，22～24 h变化不明显，趋于稳定。这是由于嗜酸乳杆菌在代谢过程中积累的糖基水解酶将黄酮类相应的苷元等降解使得发酵的龙葵果汁中总酚含量上升[10]。最优发酵条件下随着嗜酸乳杆菌的代谢，果汁的总酚含量上升明显，发酵效果良好。

图6 最优发酵条件下龙葵发酵果汁总酚变化

2.3.3 龙葵果汁黄酮含量的变化

从图7得到，在龙葵发酵果汁发酵条件0～22 h黄酮从1.20 mg/g增至1.57 mg/g，增加了30.8%，增加效果明显，24 h时变化不明显，与活菌数增加和生物降解提高，产生酶类使得龙葵果细胞壁基质分解使得黄酮增加有关。实验结果表明最优发酵条件下龙葵果汁黄酮含量增加明显，发酵效果良好。

图7 最优发酵条件下龙葵发酵果汁黄酮变化

2.3.4 龙葵果汁中活菌数的变化

由图8可知，在最优发酵条件下，龙葵果汁中嗜酸乳杆菌活菌数在0～22 h，从2.2×107CFU/mL增加到1.91×108CFU/mL，22～24 h时趋于稳定，增加效果明显。在0～4 h发酵果汁中活菌数从2.2×107CFU/mL增加至4.2×107CFU/mL，这与嗜酸乳杆菌开始活性不高、繁殖速度较慢有关，增加不明显。在4～22 h发酵果汁中活菌数增加十分明显，这与嗜酸乳杆菌活性增加、繁殖速度加快有关。

图8 最优发酵条件下龙葵发酵果汁活菌数变化

2.4 龙葵果汁抗氧化性研究

从图9中得到，未发酵龙葵果汁与最优条件下发酵龙葵果汁羟自由基清除率分别为21.2%和54.5%，龙葵果发酵后羟自由基清除率提高33.3%，差异显著(P<0.05)。未发酵龙葵果汁与最优条件下发酵龙葵果汁超氧阴离子自由基清除率分别为18.6%和51.65%，差异显著(P<0.05)，龙葵果发酵后超氧阴离子自由基清除率提高33.1%，与发酵龙葵果汁富含嗜酸乳杆菌，代谢增强和具有良好抗氧化性的酚类和黄酮物质有关[16]。

图9 发酵龙葵果汁中自由基清除能力

3 结 论

经过龙葵果汁发酵单因素实验和响应面分析表明最佳发酵工艺条件为：嗜酸乳杆菌接种量1.5%，发酵温度37 ℃，发酵时间22 h，可溶性固形物含量13%。发酵后果汁中嗜酸乳杆菌活菌数为1.94×108CFU/mL，感官评分为97分。未发酵龙葵果汁与最优条件下发酵龙葵果汁羟自由基清除率分别为21.2%和54.5%、超氧阴离子自由基清除率分别为18.6%和51.65%，发酵后果汁抗氧化性显著提高，发酵改善果汁效果良好。此外，发酵后龙葵果汁总酚含量达到1.26 μg/mL，黄酮含量达到1.57 mg/g。实验结果表明龙葵果汁接种乳酸菌发酵后活性成分含量和抗氧化性得到改善。