Design-Expert优化纤维素酶提取一点红黄酮工艺

陈文，王湘君，陈文婧，陈燕，孙宏元，何鸿源

1. 海南热带海洋学院理学院（三亚 572022）；2. 海南热带海洋学院水产与生命学院（三亚 572022）

一点红，顶端处的粉色花蕊，叶的背部呈暗红色，又名红背叶等，是菊科一点红系一年生或多年生草本，分布于中国海南、云南等南方地区，在海南多为冬季生长。一点红主要含有黄酮类、生物碱类、植物甾醇、脂肪酸等化学成分，具有抗氧化、抗菌等药理活性[1-2]。总黄酮即黄酮类化合物，具有多种药理活性，包括抗炎、抑菌、预防心血管疾病等功能[3]，对免疫力增强有很好的药理效果。近几年，科学技术呈现一种高墙式的飞跃，对其研究也在逐步深入。廖莉等[4]通过Fenton反应的方法建立起体系模型，探究黄酮提取液的浓度与清除率的关系；陈光孝等[5]在对一点红抗菌活性研究中确定细菌的代谢途径影响一点红黄酮类化合物的抗菌效果；刘文佳等[6]采用大孔树脂纯化一点红水提物黄酮。大部分一点红植株细胞壁都由纤维素构成，植物有效成分往往被包裹在细胞壁内，要使有效成分的溶出变得简易，可通过纤维素酶降解细胞壁的作用[7-11]达到目的，纤维素酶能使细胞壁疏松、降解，黄酮类物质能轻易溶出且不破坏其生物活性，提取效率高。结合多方面因素，试验采用响应面法结合纤维素酶法提取一点红黄酮，含量由高效液相色谱法测定，以保证方法的准确性，为研究一点红提供一种新思路，对后续研究一点红中黄酮类物质和开发利用一点红具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

一点红全草植株，购于三亚荔枝沟市场；5种黄酮标准品（AR），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇（AR），西陇科学股份有限公司；石油醚（AR）、磷酸（AR）、氢氧化钠（AR）、亚硝酸钠（AR）、硝酸铝（AR）、甲醇（色谱级），均购于山东西亚化学工业有限公司；纤维素酶，河南圣斯德实业有限公司。

高效液相色谱仪[岛津LC-2010A HT，岛津企业管理（中国）有限公司]；数显恒温水浴锅（HH，广州市盛蓝仪器制造有限公司）；数控超声波清洗机（KQ-250DE，昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE-52，广州亚荣生化仪器厂）；电子分析天平（CP-210，上海精科天美科学仪器有限公司）；真空冷冻干燥机（LGJ-10，北京松源华兴科技发展有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A，广州市盛蓝仪器制造有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，南京长城科工贸有限公司）；高速台式离心机（TGL-15B，上海安亭科学仪器厂）；冰箱（BCD-206TS）青岛海尔股份有限公司；多功能粉碎机（800C，东莞市方太电器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 一点红的预处理

取一点红全草植株，除去杂质自然晾干，经烘箱烘干进一步脱去水分，置于中药粉碎机中粉碎，用0.180 mm孔径（80目）标准筛过筛取细粉，密封干燥保存，以备试验使用。

1.2.2 一点红黄酮的检测

1.2.2.1 最大吸收波长的测定

用移液枪吸取一定量芦丁标准溶液（c=1.092 mg/mL）置于25 mL比色管中，吸取1 mL 5% NaNO2溶液加入，摇匀放置5 min；吸取1 mL 10% Al(NO3)3溶液加入，摇匀，放置5 min；吸取10 mL 5% NaOH溶液加入，用60%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀放置15 min；以备试验使用，测其最大最大吸收波长。

1.2.2.2 标准曲线测定

用移液枪精密吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素标准溶液（c=1.092 mg/mL）于6支10 mL试管中，配制成不同浓度葡萄糖溶液，在最大吸收波长下测定其吸光度，以浓度作横坐标，吸光度作纵坐标绘制芦丁等5种标准曲线，将试验得到芦丁等5种样品也按此方法测其吸光度，参照标准曲线可算得5种样品浓度。

1.2.3 HPLC测定总黄酮

1.2.3.1 色谱条件的确定

色谱条件：岛津LC-2010A HT型高效液相色谱仪，流动相为V甲醇∶V0.2%磷酸=60∶40，总流速0.6 mL/min；检测波长选择360 nm；进样量10 μL；柱温箱最低温度25.0 ℃，最高温度65.0 ℃；检测分析时间60 min。

1.2.3.2 进样前预处理1.2.3.3 流动相

甲醇：准备2瓶500 mL色谱甲醇，使用溶剂过滤器经0.45 μm微孔膜过滤，得到过滤后的甲醇溶液，装入流动相瓶中，超声15 min，备用。

0.2%磷酸：用移液枪精密吸取2.353 mL 85%甲醇溶液置于1 000 mL容量瓶，加入屈臣氏水定容，后使用溶剂过滤器过0.45 μm微孔膜，得到过滤后的0.2%磷酸水溶液，装入流动相瓶中，超声15 min，备用。

1.2.3.4 标准溶液制备

准确称取各10 mg芦丁、槲皮素、山奈酚、木犀草素、芹菜素标准品，用色谱甲醇溶解，分别定容至25 mL容量瓶中，配成0.4 mg/mL溶液，各吸取1 mL混合，制成混合标准样。放入冰箱避光保存备用。

1.2.3.5 供试样品溶液制备

准确称取4.00 g经过筛的一点红粉末于250 mL的锥形瓶中，选用经响应面优化的最佳条件对一点红黄酮进行提取，使用旋转蒸发仪进行浓缩并回收溶剂，浓缩后的物料置于真空冷冻干燥机中进行干燥，干燥时间为24 h；精密称取13.2 mg经干燥后的一点红黄酮，用甲醇溶解，并定容置于50 mL容量瓶中，所得总黄酮的质量浓度为0.264 mg/mL，进样品前均使用0.45 μm微孔膜过滤。

1.2.4 纤维素酶法提取样品黄酮条件

试验选择对纤维素酶用量（mg）、酶解温度（℃）、提取时间（min）、乙醇体积分数（%）、料液比（g/mL）这5个单变量因素进行考察，考察各个因素对一点红黄酮提取工艺的影响，再从中筛选出4个影响比较大的试验因素，完成初步的响应面优化工作。使用0.45 μm微孔膜过滤；每组试验称取一点红植株粉末，质量均为2.000 0 g，每组试验都进行精密度试验（同一组试验做3次平行试验）考察，SRSD均为0.98%以上，符合效能指标。

1.2.4.1 不同纤维素酶用量对黄酮提取率的影响

准确称取2.000 0 g经过筛的一点红粉末于250 mL锥形瓶中，设定提取时间90 min、酶解温度50 ℃，按料液比1∶20 g/mL加入体积分数60%乙醇，提取时，酶用量分别为6，16，26，36和46 mg，分析其结果得以确定最佳纤维素酶用量。

1.2.4.2 不同提取时间对黄酮提取率的影响

准确称取2.000 0 g经过筛的一点红粉末于250 mL的锥形瓶中，固定称取16 mg纤维素酶酶用量，设定酶解温度50 ℃，按料液比1∶20 g/mL加入体积分数60%乙醇，提取时，提取时间分别为30，60，90，120，150和180 min，分析其结果得以确定最佳提取时间。

1.2.4.3 不同料液比对黄酮提取率的影响

准确称取2.000 0 g经过筛的一点红粉末于250 mL的锥形瓶中，固定称取16 mg纤维素酶用量，设定提取时间90 min、酶解温度50 ℃，加入体积分数60%乙醇，提取时，料液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL，分析其结果得以确定最佳料液比。

1.2.4.4 不同酶解温度对黄酮提取率的影响

准确称取2.000 0 g经过筛的一点红粉末于250 mL的锥形瓶中，固定纤维素酶酶用量16 mg，设定提取时间90 min，按料液比1∶20 g/mL加入体积分数60%乙醇，提取时，酶解温度分别为40，45，50，55，60和65 ℃，分析其结果得以确定最佳酶解温度。

1.2.4.5 不同乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

准确称取2.000 0 g经过筛的一点红粉末于250 mL锥形瓶中，设定纤维素酶酶用量16 mg、提取时间90 min、酶解温度50 ℃，提取时，料液比1∶20 g/mL，乙醇体积分数分别为30%，40%，50%，60%，70%和80%，分析其结果得以确定最佳乙醇体积分数。

1.2.5 样品黄酮提取率的测定

称取2.000 0 g一点红全草植株粉末置于250 mL锥形瓶中，添加适量乙醇、适量纤维素酶，置于水浴锅内升至所需温度，保持恒温及一定时间对一点红黄酮进行提取，在90 ℃以上沸水浴上灭酶10 min，趁热抽滤，弃去滤渣，再经过高速离心机进一步除去滤渣，离心速度6 000 r/min，离心10 min，取上清液在505 nm波长处测吸光度，代入标准曲线方程计算黄酮提取率[12-14]。

式中：C为黄酮质量浓度，mg/mL；V为样品稀释溶液体积，mL；n为稀释倍数；m为一点红粉末质量，g。

1.2.6 Box-Behnken中心组合试验设计

为进一步优化试验样品处理的最佳条件、提高试验的提取率，根据单变量因素考察结果，以一点红总黄酮提取率为指标，选取对黄酮提取量影响最大及稳定性较弱的4个单因素，采用Design-Expert. V8.0.6.1分析软件进行试验设计，根据Box-Behnken中心组合设计原理[15-16]，建立四因素三水平的Box-Behnken中心组合试验，以黄酮提取率为响应值，选取对试验结果影响较大的样品处理条件，选定对提取率影响较大的酶用量（A）、提取时间（B）、酶解温度（C）和乙醇体积分数（D）作为试验考察因素，3个水平则根据4个单变量因素试验结果所确定，各因素的3个水平采用-1，0和1进行编码，每个水平都是由单因素变量考察，以确定最优提取工艺条件[17-18]，如表1所示。

表1 响应面试验的因素及水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

精密吸取1 mL经处理的混合标准样，在最大吸收波长505 nm处，按设定的色谱条件分别进样4，6，8，10和12 μL，从而得到5种黄酮标准品，即芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素的峰面积；以质量为横坐标，峰面积为纵坐标，运用Excel软件作曲线图并得出曲线方程，分析结果见表2，回归直线对测定值的拟合程度好，标准曲线可用。

表2 黄酮5种标准液曲线及相关系数

2.2 纤维素酶用量对黄酮提取率的影响

如图1所示，控制其他条件不变，只改变纤维素酶用量，一点红黄酮提取率随着纤维素酶用量增加，开始时曲线呈现升高趋势，酶用量16 mg时提取率最大，随后逐渐下降。原因可能是：纤维素酶能使一点红植物细胞壁疏松、降解，使黄酮能轻易溶出，提取率增大，但当继续增加纤维素酶用量时，过多的纤维素酶会包裹在一点红表面，使黄酮溶出变困难，故提取率降低。因此选择16 mg为最佳纤维素酶酶用量。

图1 酶用量对一点红黄酮提取率的影响

2.3 提取时间对黄酮提取率的影响

如图2所示，控制其他条件不变，只改变反应提取时间，一点红黄酮提取率随着提取时间延长，开始时曲线呈现升高趋势，在达到90 min后继续延长提取时间则呈现缓慢下降。原因可能是：刚开始时提取时间较短，酶的降解作用还没产生效果，黄酮类物质还没有溶出或溶出较少，测得提取率较低，但随着时间增加，提取率飙升很快，但继续增加提取时间，黄酮类物质有部分分解，使一点红黄酮提取率缓慢降低。因此选择90 min为最佳提取时间。

图2 提取时间对一点红黄酮提取率的影响

2.4 料液比对黄酮提取率的影响

由图3可知，控制其他条件不变，只改变料液比，一点红黄酮提取率随着液体比例增加，开始时曲线呈现升高趋势，料液比1∶20 g/mL时提取率最大，随着液体比例继续增加，提取率变化不大，有略微降低。原因可能是：在合适的料液比下，溶剂与物料一点红混合得更加充分均匀，使提取率增大，但液体比例过大时，其他物质的溶出影响黄酮类物质检测，从而使一点红黄酮提取率下降。因此选择1∶20 g/mL为最佳料液比。

图3 料液比对一点红黄酮提取率的影响

2.5 酶解温度对黄酮提取率的影响

由图4可知，保持其他条件不变，一点红黄酮提取率随着酶解温度增加，开始时曲线先呈现升高趋势，在酶解温度50 ℃时提取率出现顶峰，后随着温度的增加提取率反而下降。原因可能是：温度过低时，纤维素酶的活性不大，不能对细胞壁起到很好的降解作用，随着温度的增加，酶活性被激活，提取率逐渐上升，但继续提升温度，过高温度会导致酶失活，酶发挥不出原有的作用，使一点红黄酮提取率降低。因此选择50 ℃为最佳酶解温度。

图4 酶解温度对一点红黄酮提取率的影响

2.6 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

由图5可知，保持其他条件不变，一点红黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加，开始时曲线呈现上升趋势，乙醇体积分数50%时提取率最大，随着乙醇体积分数增加，提取率不增反降。原因可能是：乙醇体积分数过低时，不能很好地溶出一点红中黄酮类物质，致使提取率不大，增加乙醇体积分数至50%提取率最大，说明一点红提取黄酮在这个范围下最佳，继续增加乙醇体积分数会导致其他色素或除黄酮类以外的物质溶出，从而影响黄酮提取率，导致提取率降低。因此选择50%为最佳乙醇体积分数。

图5 乙醇体积分数对一点红黄酮提取率的影响

2.7 响应面法优化一点红黄酮提取工艺

2.7.1 Box-Behnken试验设计及其结果

2.7.1.1 响应面试验回归方程拟合

通过单变量因素的考察，试验确定以纤维素酶用量、酶解温度、提取时间和乙醇体积分数为自变量，一点红黄酮提取率为因变量，根据Box-Behnken中心组合设计原理，通过Design-Expert V8.0.6.1软件设计四因素三水平组合试验，进行29组提取试验。设计结果如表3所示。

表3 Box-Behnken响应面分析试验设计及结果

2.7.1.2 响应面试验优化分析

依据回归模型的分析，经过Design-Expert V8.0.6.1软件对纤维素酶用量、酶解温度、提取时间和乙醇体积分数4个因素进行分析，得到对应的等高线图及响应曲面图，如图6～图11所示，可以直观反映各因素对一点红黄酮提取率影响。

图6 酶用量与提取时间作用对提取率影响的响应曲面及等高线

图11 酶解温度与乙醇体积分数作用对提取率影响的响应曲面及等高线

响应曲面表明，提取时间在60～120 min之间，纤维素酶用量在6～26 mg之间，提取率呈现先升后降趋势，图形呈凸面状，从图形的陡峭程度来看时间后半段的交互影响没有前半段的影响大，这与单因素的影响结果一致。等高线图形趋于圆形，反映提取时间和酶用量交互作用不显著，提取率由中心向外逐渐减小。

响应曲面表明，酶用量在6～26 mg之间，乙醇体积分数在40%～60%之间，提取率呈现先升后降趋势，图形呈凸面状，从图形陡峭程度来看交互影响的结果明显。等高线图形趋于圆形，反映酶用量与乙醇体积分数交互作用不显著，提取率由中心向外逐渐减小。

图7 酶用量与乙醇体积分数作用对提取率影响的响应曲面及等高线

响应曲面表明，酶用量在6～26 mg之间，酶解温度在45～55 ℃之间，提取率呈现出先升后降的趋势，图形呈凸面状。从图形的陡峭程度来看酶用量的影响较乙醇体积分数的大，与方差分析的结果一致。等高线图形趋于圆形，反映酶用量和酶解温度交互作用不显著，提取率由中心向外逐渐减小。

响应曲面表明，提取时间在60～120 min之间，酶解温度在45～55 ℃之间，提取率呈现先升后降趋势，与单因素结果一致，图形呈凸面状，从图形陡峭程度来看交互影响的结果明显。等高线图形趋于圆形，反映提取时间与酶解温度交互作用不显著，提取率由中心向外逐渐减小。

图8 酶用量与酶解温度作用对提取率影响的响应曲面及等高线

图9 提取时间与酶解温度作用对提取率影响的响应曲面及等高线

响应曲面表明，提取时间在60～120 min之间，乙醇体积分数在40%～60%之间，提取率呈现先升后降趋势，与单因素结果一致，图形呈凸面状，从图形的陡峭程度来看交互影响的结果明显。等高线图形趋于圆形，反映提取时间与乙醇体积分数交互作用不显著，提取率由中心向外逐渐减小。

图10 提取时间与乙醇体积分数作用对提取率影响的响应曲面及等高线

响应曲面表明，乙醇体积分数在40%～60%之间，酶解温度在45～55 ℃之间，提取率呈现出先升后降的趋势，与单因素结果一致，从图形陡峭程度来看交互影响结果明显。等高线图形趋于圆形，反映酶解温度与乙醇体积分数交互作用不显著，提取率由中心向外逐渐减小，中心提取率最大。

2.7.1.3 方差分析

采用Design-Expert. V8.0.6.1软件对表3数据进行多元回归拟合及方差分析，经拟合后得到以一点红黄酮提取率为目标的函数，关于各因素即酶用量（A）、提取时间（B）、酶解温度（C）、乙醇体积分数（D）为编码值的二次回归方程为提取率=2.84+0.05A-0.02B-0.044C-0.041D-0.095AB+0.023AC-0.043AD+0.038BC+0.033BD-0.073CD-0.268A2-0.278B2-0.367C2-0.272D2。所得的方差分析如表4所示。

由表4所示，获得回归方程模型P=0.000 1（P＜0.01），说明该模型具有极显著的显著性，即一点红黄酮提取率与各因素之间的影响显著，回归方程模型在统计学上具有意义，模型一次项A（P=0.088 5）、B（P=0.952 2）、C（P=0.128 1）、D（P=0.157 1）为差异不显著项。从显著性的结果即P值大小可以表明，4个单变量因素影响顺序为纤维素酶用量（A）＞酶解温度（C）＞乙醇体积分数（D）＞提取时间（B）。交互项中AB（P=0.064 3）、AC（P=0.641 7）、AD（P=0.384 1）、BC（P=0.441 2）、BD（P=0.503 3）、CD（P=0.147 6）为差异不显著项。在二次项中A2（P=0.000 1）、B2（P=0.000 1）、C2（P=0.000 1）、D2（P=0.000 1）为极显著项。R2=0.929 6，可以认为有92.96%的响应值变化，数据拟合程度较好。根据Design-Expert V8.0.6.1软件分析，得出一点红黄酮最佳提取条件：纤维素酶用量17.02 mg，提取时间89.14 min，酶解温度49.7 ℃，乙醇体积分数49.21%，得出的预期试验提取率为2.85%。按照优化的条件进行工艺验证试验，进行6次平行测定，由测定结果，计算出相对标准偏差。相对标准偏差（SRSD）是标准偏差（SSD）与平均值的比值再乘以百分之百，即SRSD=（SSD/平均值）×100%[19-20]，6次平行测定的结果为2.84%，2.88%，2.86%，2.83%，2.84%和2.88%，相对标准偏差为0.76%，重复性的结果可靠，且6次测定的结果与预期结果相差不大，该优化工艺可靠，具有真实性。

表4 回归模型的方差分析及显著性分析结果

2.8 HPLC试验结果与分析

2.8.1 液相图谱分析

由图12分析，芦丁的保留时间为7.356 0 min，槲皮素的保留时间为14.889 0 min，木犀草素保留时间为17.583 0 min，山萘酚的保留时间为23.487 0 min，芹菜素的保留时间为25.579 0 min。

图12 5种黄酮混合标准品色谱图

2.8.2 黄酮含量的分析

将一点红样品在高效液相测出来的各黄酮含量所对应的峰面积（3次平行测定取平均值）代入所对应的黄酮标准液的线性方程之中，结果显示，芦丁、槲皮素、山萘酚含量分别为0.144，0.022和0.146 mg/g。样品的色谱图及计算结果见图13和表5。

表5 一点红黄酮含量计算结果

图13 一点红样品色谱图

由图13分析，芦丁的出峰时间为7.356 0 min，槲皮素的出峰时间为14.889 0 min，山萘酚的出峰时间为23.487 0 min，与标准品图谱相对应。

3 结论与讨论

试验以三亚荔枝沟市场采购一点红全草植株为研究对象，经单因素考察，再通过响应面试验优化设计提取条件，确定纤维素酶提取一点红黄酮的最佳试验条件，采用HPLC法测定一点红中黄酮含量。对单变量因素考察发现：纤维素酶用量16 mg、酶解温度50 ℃、料液比1∶20 g/mL、提取时间90 min、乙醇体积分数50%为最佳条件；选取其中4个影响较大的因素进行响应面试验优化，一点红黄酮最佳提取条件为纤维素酶用17.02 mg、提取时间89.14 min、酶解温度49.7 ℃、乙醇体积分数49.21%，预期试验提取率为2.85%。高效液相色谱条件为流动相V甲醇∶V0.2%磷酸=60∶40、总流速0.6 mL/min、检测波长360 nm、进样量10 μL、柱温箱最低温度25.0 ℃、最高温度65.0℃、进样检测分析时间60 min。采用HPLC测一点红黄酮含量，对照标准样的色谱图和样品色谱图，可以看出分离结果较好，可以明显观察到芦丁、槲皮素、山萘酚峰值出现，样品中芦丁、槲皮素、山萘酚的含量分别为0.144，0.022和0.146 mg/g，木犀草素和芹菜素未检出。方差分析发现纤维素酶用量是影响黄酮提取率关键因素，优化工艺可靠，具有真实性。试验方案条件温和，能保全黄酮活性不被破坏，具备对黄酮活性后续试验连续性、可操作性及数据有效性。该方法不仅能够提高提取率，同时减少操作成本，操作简便，提取结果令人满意。